Взаимодействие низкомолекуляных соединений с мембранами (стр. 7 из 8)
4.1. ИЗМЕРЕНИЕ ТРАНСМЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА
Величину трансмембранного потенциала лучше всего измерять с помощью двух электродов, помещенных по разные стороны мембраны. Однако этот способ применим лишь для плоских модельных мембранных систем и некоторых крупных клеток. Обычно же приходится измерять потенциал на мембране либо протеоли-посом, либо клеток или органелл, например митохондрий или хло-ропластов. Для этих случаев разработано несколько методов.
1. Распределение ионов в соответствии с уравнением Нернста. В систему добавляют ион, способный проникать через мембрану, и он перераспределяется между внешней средой и внутренним объемом в соответствии с уравнением Нернста. На этом принципе основано использование в качестве молекулярных зондов таких гидрофобных ионов, как ТФФ+ или 86кЬ-валиномицин. Чтобы определить трансмембранный потенциал, нужно знать концентрацию иона внутри везикулы, органеллы или клетки, что нередко превращается в серьезную проблему. Ошибки в измерении Д* могут, в частности, возникнуть, если большие количества зонда связываются с мембранами клетки или если неправильно определен внутренний объем.
2. Спин-меченные ЭПР-зонды. Для этой цели используют несколько зондов — гидрофобных ионов, к которым ковалентно пришита парамагнитная нитроксильная группа. Концентрацию зонда, связанного с мембраной, легко определить из спектра ЭПР; при образовании на мембране потенциала зонд перераспределяется между фазами, и по изменению его концентрации в мембране можно оценить величину Д*. Изменение концентрации мембраносвязанного зонда обусловлено тем, что для внутривезику-лярного пространства отношение площади поверхности к объему гораздо больше, чем для внешнего раствора.
3. Оптические молекулярные зонды. Спектральные характеристики многих оптических зондов зависят от трансмембранного потенциала. Из наиболее распространенных назовем флуоресцентные производные мероцианина, оксонола и цианиновые красители. Все эти соединения связываются с мембраной, и, по-видимому, в основе их реакции на изменения трансмембранного потенциала может лежать несколько механизмов. Чаще всего взаимодействие электрического диполя, каким является зонд, с электрическим полем приводит к изменению ориентации диполя в бислое. В ряде случаев изменение степени агрегации зонда в бислое влечет за собой изменение квантового выхода флуоресценции. Большинство зондов применяют для определения трансмембранного потенциала, имеющего знак минус внутри везикулы, однако некоторые красители, например оксонолы, используются при обратной полярности потенциала.
К зондам другого типа, спектр поглощения которых чувствителен к трансмембранному потенциалу, относятся соединения стирольной природы, образующие в мембране конъюгированные структуры. Изменение их спектров поглощения при наложении потенциала обусловлено так называемым явлением электрохро-мизма. Переход молекулы зонда из основного состояния в возбужденное при поглощении кванта света сопровождается перераспределением электронов. На энергию электронного перехода влияет градиент потенциала, вектор которого параллелен направлению этого смещения заряда. Подобные электрохромные изменения спектра наблюдаются также для природных пигментов фотосинтетических мембран — каротиноидов. Преимущество зондов этого типа состоит в том, что соответствующие реакции происходят очень быстро и не зависят от степени агрегации или распределения зонда. Все эти свойства делают такие зонды особенно полезными для быстрых кинетических измерений.
4.2 КОНЦЕПЦИЯ ЭНЕРГИЗОВАННОЙ МЕМБРАНЫ
Термин «энергизованная мембрана» трактуется обычно довольно широко, но в действительности он означает лишь, что поток ионов через бислой может использоваться для совершения работы. Чаще всего ионный поток создают протоны, и разность электрохимических потенциалов протонов между двумя разделенными бислоем фазами называется протондвижущей силой.
— разность электрохимических потенциалов протонов, выраженная в Дж/моль; частное от деления этой величины на постоянную Фарадея будет иметь размерность мВ.
А* = относительно наружного раствора,
ДрН = относительно наружного раствора.
При 30 °С
Протондвижущая сила является мерой изменения свободной энергии при переносе протонов с одной стороны мембраны на другую. В митохондриях и фотосинтетических системах за счет протондвижущей силы происходит синтез АТР, но она может использоваться и системами транспорта растворенных веществ. Все сказанное выше детально рассматривается в рамках хемиосмотической теории.
Для нахождения Дн, нужно знать как Д*, так и ДрН. Методы определения Д* мы обсудили выше. ДрН обычно оценивают из данных по распределению по обе стороны мембраны слабых кислот или оснований. Их нейтральные формы проникают через липидный бислой, а непроникающие заряженные формы накапливаются в зависимости от рН с той или другой стороны мембраны. Можно использовать для этой цели как радиоактивные производные, так и оптические зонды. Один из наиболее часто используемых для измерения ДрН зондов — 9-аминоакридин — аккумулируется внутри везикул с кислым содержимым, что ведет к тушению флуоресценции зонда.
5. Проницаемость липидных бислойных мембран для ионов
Как мы уже говорили, бислой создает весьма высокий энергетический барьер для ионов металлов. Коэффициент проницаемости однослойных везикул для Na+ составляет всего 10" 12—Ю-14 см/с, но даже столь малая величина на порядок выше скорости, предсказываемой исходя из модели растворения—диффузии, если воспользоваться уравнением Борна для оценки энергии, необходимой для перемещения иона из водной фазы в центр мембраны. Механизм переноса ионов через липидный бислой пока неясен, но в литературе обсуждается несколько конкурирующих теорий, в основе которых лежит предположение о существовании дефектов упаковки молекул фосфолипидов в бислое. Постулируется, что эти дефекты возникают спонтанно, подобно флуктуирующим полостям или кинкам, либо формируются на границе раздела сосуществующих в мембране жидкокристаллической фазы и фазы геля. Ионная проницаемость в общем случае максимальна при температуре фазового перехода гель — жидкий кристалл, но это не так для воды и протонов. Следует напомнить, что стационарный поток ионов через бислой должен быть электронейтральным, т. е. для поддержания нейтральности поток одних ионов должен быть сопряжен с потоком других ионов.
Как бы то ни было, ясно, что бислой представляет собой труднопреодолимый барьер для простых анионов и катионов. Однако, как уже говорилось, ионы большего радиуса из-за уменьшения энергии Борна будут легко проникать через мембрану. Довольно легко могут пересекать бислой и гидрофобные ионы.
5.1 ПРОНИЦАЕМОСТЬ ДЛЯ ПРОТОНОВ
Как показывают измерения на модельных мембранах, проницаемость липидного бислоя для протонов исключительно высока. Экспериментально отличить проницаемость для протона от проницаемости для гидроксила довольно трудно, поэтому в литературе ее обозначают Н + /ОН". В дальнейшем эту проницаемость мы будем для простоты называть протонной. Приводимые в литературе значения коэффициента проницаемости для протона варьируют в довольно широких пределах, обычно от Ю-4 до 10 8 см/с. Столь значительный разброс объясняют экспериментальными различиями в размерах везикул, в величине создаваемого трансмембранного градиента рН, в степени ненасыщенности липидов. Ясно тем не менее, что проницаемость для протона по крайней мере в 106 раз выше, чем для других простых ионов, причем это относится как к биомембранам, так и к модельным системам.
Приведенные данные однозначно указывают на существование специального механизма протонной проницаемости. Это, в частности, подтверждает тот факт, что скорость транспорта протонов не определяется простым электростатическим барьером в мембране. Природа этого явления неизвестна. Согласно одной из моделей, в мембране имеются временные пересекающие всю толщу бислоя цепочки из молекул воды, соединенных водородными связями; по этим цепочкам по эстафетному механизму и осуществляется перенос протонов. Однако прямых даннах о существовании таких цепочек воды пока нет. В других работах постулируется, что аномально высокая проводимость фосфолипидных бислоев для протонов обусловлена в основном присутствием в мембране небольших количеств слабых кислот, например свободных жирных кислот, которые при физиологических рН выступают в роли переносчиков протонов. Однако расчеты показывают, что всю аномально большую протонную проводимость липосом эта гипотеза объяснить не может.
Было показано также, что протоны способны быстро диффундировать вдоль границы раздела мембрана—раствор и протонировать анионные формы адсорбированных на поверхности мембраны слабых кислот. При этом околоповерхностный барьер для быстрого установления равновесия по протонам между наружным раствором и протонированными группами на поверхности мембраны отсутствует.