Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина (стр. 4 из 8)
В гетерофазных системах, таких как клетки или липопротеины, антиоксидантная эффективность флавоноидов во многом определяется их липофильностью и гидрофильностью [3, 15]. В экспериментальной системе окисления рапсового масла при 105 °С мирицетин проявлял значительно более выраженную ингибирующую активность, чем кверцетин, однако в другой модельной системе (окисление липидов мембран эритроцитов) эффективнее был кверцетин, что связывается с его большей липофильностью [15]. Анализ действия разных по структуре флавоноидов на индуцированные ионами железа процессы ПОЛ в выделенных митохондриях также показал, что их активность главным образом зависит от хелаторных и липофильных свойств молекул, при этом метилирование всех ОН-групп в молекуле кверцетина не снижало антиокислительной активности [67]. На модели ишемии/реперфузии изолированного сердца крысы катехин, введённый в перфузат, предотвращал высвобождение ионов железа и снижал повреждение митохондрий [77].
Помимо того, что флавоноиды обладают антирадикалыюй активностью и могут связывать ионы металлов переменной валентности, они аналогично токоферолу и холестерину стабилизируют мембраны и выступают в качестве структурных антиоксидантов. Проникая в гидрофобную область мембран, молекулы флавоноидов значительно снижают подвижность липидов, что в свою очередь, снижает эффективность взаимодействия пероксильных радикалов с новыми липидными молекулами (RО2* + RH —> ROOH + R*); так как в большинстве биологических мембран данная стадия цепных процессов ПОЛ является лимитирующей, то, соответственно, снижается скорость всего процесса окисления [4].
Показано ингибирование флавоноидами активности самых разных ферментов, таких как липоксигеназа, циклооксигеназа, монооксигеназы, ксантиноксидаза, митохондриальные сукцинатдегидрогеназа и НАДН-оксидаза, фосфолипаза А2 [13, 31], топоизомеразы и всевозможные протеинкиназы: протеинкиназа С, протеин-киназа В (Akt), мембранная и цитозольная тирозинкиназы, фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), внеклеточнорегулируемая киназа (ERK), казеинкиназа 2 (СК2), АМФ-активируемая протеинкиназа (АМРК), и многие другие [20, 54, 56], при этом подавление активности киназ осуществляется преимущественно по одному общему механизму, путём конкуренции с АТФ за соответствующий участок связывания на ферменте [54].
1.3.5 Противоопухолевая активность флавоноидов
Синтетические производные флавоноидов, например, флавонуксусная кислота на данный момент уже прошли 1 фазу клинических испытаний, и уже скоро могут быть использованы в качестве цитостатических препаратов [23,28].
Ингибирование роста опухолевых клеток флавоноидами в моделях invivo и invitro встречается во многих работах [41,68]. Эти исследования проводились как на химически-индуцированных опухолях [52], так и на опухолях вирусного происхождения [80]. Тем не менее эффекты, оказываемые флавоноидами на опухолевые клетки столь разнообразны, что поиск механизмов действия продолжается до сих пор.
Изобилие эффектов флавоноидов на метаболизм опухолевых клеток разделяют на несколько основных, определенных механизмов.
Флавоноиды вовлекаются в большое количество регулирующих путей, таких как рост, энергетический метаболизм, апоптоз, дифференцировка клетки, транскрипция, репарация ДНК, передача нервных импульсов, воспаление, и окислительный стресс [7,30,38].
Таким образом, флавоноиды могут действовать как антиоксиданты, ловушки свободных радикалов, ингибиторы ферментов, гормоны (в том числе и как медиаторы) или индукторы экспрессии генов.
Высокая подвижность электронов в ароматическом ядре флавоноидов объясняет их антиоксидантные свойства, тогда как структурное сходство флавоноидов со многими соединениями, участвующими в жизнедеятельности клетки, объясняет их ингибирующее действие на ферменты, связывание с цитоплазматическими и ядерными рецепторами гормонов и медиаторов, а так же на индукцию экспрессии генов. Примером последнего является индукция кумарином генов протеазы при отеках [58]. Высокая аффинность флавоноидов с ионами тяжелых металлов обеспечивает дополнительные возможности их влияния на работу ферментов. Рассмотрим некоторые из биологических активностей флавоноидов.
Некоторые флавоноиды ингибируют тирозинспецифические киназы [26]. В результате чего рост и пролиферация опухолевых клеток так же может замедляться [29]. Другая возможность - влиять на рост опухолевых клеток была обнаружекна при изучении работы Na+/K+-АТФазы.
Потребность опухолевых клеток в АТФ довольно высока и в итоге начинает превышать возможности его наработки клеткой. Главным источником АТФ, в условиях недостатка кислорода, что сопровождается бурным ростом опухолевых клеток, становится гликолиз. В процессе работы гликолитических ферментов концентрация молочной кислоты повышается, что приводит к снижению pH, положительно влияя на работу лизосомальных ферментов, но при этом ингибируются многие ферменты. Снижение концентрации АТФ может приводить к тому, что активность Na+/K+-АТФазы будет снижаться [74], что приведет к возрастанию в цитоплазме концентрации ионов Na+. Таким образом, интенсивность транспорта глюкозы в клетку, которая является зависимой от градиента ионов Na+, снижается и эффективность фосфорилирования АДФ падает.
Рэкер с коллегами показал [35,70,71] (SpectorM., et.al., 1980a, 1980b;), что транспортная Na+/K+-АТФаза линии опухолевых клеток (HELA), в отличие от фермента в нормальных клетках, фосфорилируется по тирозиновому остатку регуляторной β-цепи. Ими было определено, что кверцетин дефосфорилирует фенольную группу тирозина в β-цепи транспортной Na+/K+-АТФаза (рис. 5). Это фактически ведет к ингибированию Na+/K+-АТФазы опухолевых клеток [70,71] и к нарушению ионного гомеостаза опухолевых клеток и снижение транспорта глюкозы.
Рис.5 Предположительный механизм действия кверцетина на работу Na+/K+-АТФазы. (из обзора Havsteen B.H., 2002) a. Контур гексамерного агрегата α- и β-цепей Na+/K+-АТФазы (по данным РСА). b. Регулирование Na+-насоса фосфорилированием β-субъединицы, катализируемое фосфокиназой (слева) и работа насос,а запусакаемая гидролизом АТФ (справа). c. Предположительный механизм дефосфорилирования тирозина β-субъединицы.
Ингибирование флавоноидами транспортера глюкозы в плазматической мембране опухолевых клеток было обнаружено и другими авторами [37,65,66]. Учитывая то, что регулирующая β-цепь митохондриального протонного насоса структурно схожа с β-цепью Na+/K+-АТФазы, можно предпологать, что протонный насос, вероятно, также регулируется реакцией фосфорилирования/дефосфорилирования и, соответственно, является чувствительным к флавоноидам [8,35].
Цитостатический эффект флавоноидов по отношению к опухолевым клеткам, наблюдаемый Рэкером [48], частично был приписан им к индукции этими соединениями апоптоза. Однако в дальнейшем этот факт стал интерпретироваться как результат воздействия на стресс-отвечающие гены, в особенности кодирующих БТШ [39,47]. Однако эффекты БТШ и кверцетина (или подобных ему флавоноидов) противоположны, потому как кверцетин способствует вхождению клетки в апоптоз, а БТШ способствуют выживанию клетки. И действительно, было обнаружено, что кверцетин ингибирует экспрессию БТШ-70, опосредованно через ингибирование активации промотора ФТШ (фактора теплового шока) [36]. Помимо кверцетина, флавоноид генистеин также ингибировал активацию HSF, но не предотвращал при этом его связывание с ДНК [59]. Вместо этого генистеин влияет на вторую стадию активации ФТШ - фосфорилирование, ингибируя активность фосфокиназы [2,57]. Так как БТШ вовлечены во многие клеточные процессы, например, клеточный цикл, дифференцирование, апоптоз [78], развитие и трансформацию, исследования регулирования активности ФТШ и БТШ является важным этапом исследования действия флавоноидов на опухолевые клетки. Роль БТШ как антагонистов индукции апоптоза под действием кверцетина до сих пор остается не понятна.
Кверцетин может действовать синергично с цитостатическими агентами и ингибиторами биосинтеза белков в индукции апоптоза. Циклогексимид, ингибитор трансляции белка, вызывает апоптоз у 40 ± 2 % клеток, уровень которого возрастает до 76 ± 2 % в присутствии кверцетина [25]. Аналогичный эффект наблюдается и с адриномициом D, ингибитором транскрипции, под действием которого уровнь апоптотических клеток возрастает от 19±3 % до 91 ± 5 % в присутствии кверцетина [33].
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 МАТЕРИАЛЫ
Люминол, пероксидаза хрена, HEPES, лецитин – производства «Sigma». Пероксид водорода, тиобарбитуровая кислота, фосфорная кислота, NaCl, CaCl2, MgCl2, FeSO4, глюкоза – «ЗАО Мосреактив» - Москва. Дигидрокверцетин – НПФ “Флавит”, ИБП РАН, Пущино.
2.2 ЖИВОТНЫЕ
В экспериментах использовали крыс-самцов линии Вистар весом 200 - 300 г. Крысы содержались в условиях вивария на стандартном рационе при свободном доступе к воде и пищи, при температуре 16-20°С в режиме естественной освещенности.
2.3 ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕРИТОНИАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ
Макрофаги выделяли сразу после умерщвления крысы (по средствам декапитации) Крыса закреплялась на препаратном столике брюшком к верху, брюшко обрабатывалось 70% этиловым спиртом, производился надрез кожи вдоль туловища с паховой области до грудной клетки и поперёк в районе задних конечностей, образовавшееся лоскуты кожи закреплялись. Затем с помощью шприца внутрибрюшинно (не задевая кишечник) вводили 10-11 мл холодной среды RPMI-1640 с некоторым количеством воздуха. После этого массировали брюшную стенку в течении 2-3 минут, для отделения макрофагов перитониальной полости в суспензию. Затем, осторожно, не задевая кишечника, вводили иглу с правой стороны брюха животного и отбирали суспензию содержащую макрофаги. Суспензию сразу переносили в стерильную стеклянную пробирку и помешали в холодильник.