Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина (стр. 5 из 8)
После выделения макрофаги подсчитывали в камере Горяева (в среднем выделяется около 1 мил. клеток в мл).
2.4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКЦИИ АФК ФАГОЦИТИРУЮЩИМИ КЛЕТКАМИ
После выделения макрофаги концентрировали центрифугированием. Для этого пробирку, содержащую суспензию макрофагов помещают в охлаждённую до 4°С центрифугу и центрифугируют при 1000 об/мин в течении 10 мин. Получившейся осадок клеток ресуспендируют в 200 мкл солевой буфер и оставляют на холоду на 1 час.
Для измерения продукции активных форм кислорода в ответ на стимул применялся метод люминол зависимой хемилюминесценции, основанный на окислении люминола активными формами кислород с выделением аминофталата и испусканием кванта света. Для этого в ячейку помещали 500 мкл среды регистрации с pH=7.6, содержащей 0.9% NaCl; 5 mM HEPES; 5 mM глюкозы; 1 mM CaCl2 и 10-4 моль люминола, добавляли суспензию клеток и, через определённое время инкубации, добавлялся PMA (10-6 моль/л), в качестве стимула. Хемилюминесценцию регистрировали на люменометре “Биотокс -7”
2.5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ДГК МЕТОДОМ ЛЮМИНОЛ-ЗАВИСИМОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
Определение степени ингибирования процесса образования АФК в присутствие флавоноида в модельной биохимической системе, содержащей пероксид водорода, пероксидазу хрена и люминол, было выполнено на хемилюминометре «Биотокс 7» («Инженерный Центр – Экология», г. Москва, Россия). Измерение проводили при температуре 37°С, pH=7,3.
Среда для регистрации АФК содержала: NaCl -150 мМ, HEPES -5 мМ, глюкоза - 5 мМ, CaCl2 - 1 мМ, MgCl2 - 1 мМ, pH - 7,4 при температуре 37оС. Модельная система содержала: 0,5 мл среды регистрации, 250 мкМ люминола, 4 U/мл пероксидазы хрена и 30 мкМ пероксида водорода.
Антиоксидантная активность (АОА) оценивалась по снижению максимальной интенсивности ХЛ вдвое. При определении АОА антиоксидант вводился в модельную систему до добавления пероксида водорода. Величину АОА дигидрокверцетина (ДГК) определяли интерполяцией экспериментальных значений интенсивностей ХЛ от концентрации антиоксиданта в модельной системе. Для анализа полученных данных по АОА исследуемого соединения, нами была выбрана концентрация антиоксиданта (C50%), которая снижала интенсивность хемилюминесценции вдвое, в отличие от принятой рядом авторов величины 1/C50% [81].
2.6 ИЗУЧЕНИЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ПРИСУТСТВИИ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
Влияние на процесс образования продуктов ПОЛ, таких как малоновый диальдегид (МДА) и монокарбонильные соединения, в присутствие флавоноида определялось по реакции образующихся альдегидов с тиобарбитуровой кислотой.
В пробирки, содержащие 1 мл раствора лецитина (N мг/мл), добавляли ДГК и сульфат железа (II) в концентрациях 0, 1, 5, 10 мМ для флавоноида и 0, 1, 5, 10 мМ для соли железа в разных комбинациях. Далее раствор липида инкубировался при 37оС в течение 16 суток и анализировался на содержание карбонильных соединений и ненасыщенных групп. Аналогичным образом проводили инкубацию растворов липида в присутствии 10 мМ пероксида водорода.
К 50 мкл суспензии липида добавляли 450 мкл раствора тиобарбитуровой кислоты (2,5 мг/мл) в 2% ортофосфорной кислоте. Полученный раствор инкубировался при 100оС в течение 1 часа и затем окрашенный продукт экстрагировался 500 мкл н-бутанола. Из спиртового экстракта регистрировался спектр в диапазоне 450-650 нм (спектрофотометр UV-Vis “Specord-M40”, Carl Zeiss, Германия). Математическими методами определялась оптическая плотность при 460, 500 и 532 нм, которые характерны для максимумов поглощения соответствующих ТБК-КС (карбонильных соединений). Наличие пиков адсорбции, характерных для образования аддуктов с ТБК при 490 и 510 нм обусловлено образованием монокарбонильных соединений (альдегидов), реагирующих с ТБК, тогда как для продукта конденсации ТБК-МДА характерно поглощение при 532 нм [44, 46].
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
В качестве объекта исследования был выбран природный флавоноид – дигидрокверцетин. В силу своей природы, данный флавоноид, являясь полифенолом, способен проявлять ряд свойств характерных для данного класса соединений. В первую очередь все флавоноиды обладают свободными гидроксильными группами, благодаря чему водные растворы этих соединений обладают низкими значениями pH. Во-вторых, наличие близко расположенных гидрокси-групп способствует хеллатированию ионов металлов, ингибируя, таким образом, реакцию Фентона. В третьих возможность делокализации заряда при образовании радикала флавоноида, объясняет его антиоксидантные свойства. Данные три аспекта хорошо описывают биологическое действие флавоноида в условиях окислительного стресса в биологических системах.
3.1 АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
Первым этапом наших исследований было изучение антиоксидантных свойств дигидрокверцетина. Антиоксидантная активность (АОА) определяется различными методами, в том числе наиболее часто для этой цели используют модельную систему: люминол-H2O2-катализатор, где в качестве катализатора могут выступать пероксидаза, гемоглобин или соли металлов переменной валентности. Под антиоксидантными свойствами соединения подразумевают его антиокислительную (АОА) и антирадикальную активности (АРА). Антиокислительная активность определяется различными методами, в том числе наиболее часто для этой цели используют модельную систему: люминол-H2O2-катализатор, где в качестве катализатора могут выступать пероксидаза, гемоглобин или соли металлов переменной валентности. В данной работе определяли АОА и АРА ингибиторов свободнорадикальных реакций в модельной биохимической системе, содержащей люминол, пероксидазу хрена и пероксид водорода.
Рис.6 Типичные кривые интенсивности хемилюминесцентного ответа в модельной системе в зависимости от концентрации дигидрокверцетина (введение антиоксиданта до начала реакции).
Если рассмотреть модельную систему с точки зрения образования РФК, понятно, что в начальный период основной формой окислителя является перекись водорода, вследствие чего добавка антиоксиданта в начале ХЛ-ответа позволяет судить нам о его антиокислительных свойствах.
С другой стороны достижение равновесия, визуально наблюдаемого в максимуме хемилюминесценции, сопровождается взаимодействием антиоксиданта как с молекулярной формой (H2O2), так и наиболее предпочтительнее с его радикальными формами, позволяя судить об антирадикальных свойствах.
Рис.7 Типичные кривые изменения уровня РФК в максимуме хемилюминесценции при добавлении дигидрокверцетина.
Антиоксидантные свойства флавоноидов (в том числе и для ДГК) напрямую зависят от их липофильных свойств, т.е. с уменьшением молекуляной массы увеличивается их АРА. Тем не менее, не только это является основополагающим для данной группы антиоксидантов. Такие производные, как пентаацетат ДГК и пентабензоат ДГК обладают слабой активностью, вследствие отсутствия свободных группировок, и единственно возможным путем реагирования со свободными радикалами может быть присоединение радикала по карбоксильной группе с образованием метастабильных радикалов орто-кислот, с дальнейшим отщеплением эфирной группировки (Шаталин Ю.В., и др. 2008). Альтернативный механизм реакции с подобными антиоксидантами является гидролитическое расщепление антиоксиданта до исходных компонентов и дальнейшая реакция их с радикальными формами. Второй путь является известным явлением, характерным для расщепления производных флавноноидов и эфиров полифенольных соединений в организме животных. Подобное расщепление выполняется рядом арилэстераз, присутствующих и в плазме крови. Но в модельных системах данный процесс маловероятен.
В качестве другой модельной системы была выбрана система, где в качестве источника генерации АФК были использованы полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ) здорового животного и опухоленосителя, которые в ответ на стимул (ФМА) способны продуцировать супероксид-анион с последующим молекулярным превращением его в другие активные формы кислорода. Такой подход позволяет оценить действие антиоксидантов на респираторный взрыв фагоцитов. В системе данного типа происходит взаимодействие антиоксидантов с радикальными формами кислорода.
В данной системе наблюдалось снижение чувствительности системы к возрастающему количеству антиоксиданта, что связано с насыщенностью им водной фазы и накоплением в липидном слое клеточной мембраны и что проявляется в расхождении между значениями между антиоксилительной активностью и антирадикальной активностью флавоноида на 2 порядка. Благодаря постоянной диффузии между двумя фазами и по мере окисления антиоксиданта в растворе, происходит обмен окисленных форм антиоксиданта на восстановленные из липидной фазы.