Исследование денатурации белка под действием ионных детергентов (стр. 3 из 3)

Из рис. 4.2 видно, что более сильное тушение собственной триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина, наблюдаемое в растворах с ДСН, при одинаковых концентрациях ДСН имеет место при более низких значениях pH. Данная закономерность говорит об электростатическом механизме взаимодействия сывороточного альбумина человека с ДСН. ДСН в растворе диссоциирует на положительно заряженные катионы натрия и додецилсульфат-анионы, которые и взаимодействуют с белком. Молекулы сывороточного альбумина человека в целом заряжены положительно при pH, меньших pI альбумина.

Поэтому при низких значениях pH происходит интенсивное связывание в целом положительно заряженных макромолекул белка с додецилсульфат-анионами, вследствие чего происходит сильное тушение триптофановой флуоресценции альбумина. По мере увеличения pH в целом положительный заряд макромолекулы альбумина уменьшается, а при pH, больших pI, макромолекулы альбумина приобретают в целом отрицательный заряд. Поэтому при высоких значениях pH (больших pI) происходит слабое связывание додецилсульфат-анионов и в целом отрицательно заряженных молекул альбумина, хотя еще и сохраняющих какие-то положительно заряженные участки на своих поверхностях, вследствие чего в растворах с ДСН происходит слабое тушение триптофановой флуоресценции альбумина. Следовательно, более сильная денатурация белка под действием ДСН имеет место при pH, меньших pI белка.

Установленные из экспериментальных данных зависимости интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека при различных значениях pH от концентрации ДСН (рис. 4.2) можно объяснить двустадийным механизмом денатурации этого белка в присутствии ДСН. первая переходная стадия денатурации белка – разрыхление белковых глобул, вторая стадия денатурации – разворачивание аминокислотной цепи белка.

. При концентрациях ДСН, меньших 1 мМ, происходит тушение триптофановой флуоресценции альбумина для всех pH, что указывает на первую стадию денатурации сывороточного альбумина человека – разрыхление глобул.

Дальнейшее увеличение (больше 1 мМ) концентрации ДСН при pH, больших изоэлектрической точки альбумина (pI 4,7) имеет практически постоянные значения интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции, , следовательно, денатурация останавливается на первой стадии.

Иной характер зависимостей от концентрации ДСН наблюдается при pH, меньших pI белка в области концентраций ДСН от 1 мМ до 2 мМ интенсивность в максимуме спектра триптофановой флуоресценции имеет практически постоянные значения. При этих концентрациях ДСН (до 2 мМ) происходит первая переходная стадия денатурации белка: белковые глобулы разрыхляются, но полного разворачивания еще не произошло. При дальнейшем увеличении концентрации ДСН до 3 мМ происходит дальнейшее тушение триптофановой флуоресценции альбумина, что говорит о том, что белковые молекулы из переходного состояния разрыхленности переходят во вторую стадию денатурации - стадию полного разворачивания. При увеличении концентрации ДСН свыше 3 мМ (до 7 мМ) более сильного тушения триптофановой флуоресценции альбумина не происходит, что указывает на полную денатурацию молекул альбумина. Следовательно, подобное двухэтапное тушение собственной флуоресценции белка при увеличении концентрации ДСН при этих значениях pH, меньших pI белка, объясняется двустадийным механизмом его денатурации и последовательными конформационными перестройками белковой глобулы, приводящими к оголению триптофана и увеличению его доступности для молекул воды, тушащих его флуоресценцию.

На рис. 4.3. изображена зависимость квантового выхода триптофановой флуоресценции сывороточного альбумина человека (5 мкМ) от концентрации ДСН при различных значениях рН растворов. Из этой зависимости следуют аналогичные выводы о денатурации САЧ под действием ДСН.

1000