Следовые явления в процессе возбуждения клетки. В конце ПД, например в скелетной мышце, нередко наблюдается замедление реполяризации, что называют отрицательным следовым потенциалом. Затем может быть зарегистрирована гиперполяризация клеточной мембраны, что более характерно для нервных клеток. Это явление называют положительным следовым потенциалом. Вслед за ним может возникнуть частичная деполяризация клеточной мембраны, которую также называют отрицательным следовым потенциалом, как и в случае замедления фазы реполяризации. Во-первых, необходимо отметить, что имеет место терминологическая путаница (два разных по происхождению отрицательных следовых потенциала). Во-вторых, замедление фазы реполяризации вообще не является следовым процессом — это часть фазы реполяризации, которая задерживается вследствие уменьшения проницаемости клеточной мембраны для К+ и замедления выхода его из клетки. В-третьих, термин «потенциал» применяется в других случаях: ПП, ПД, локальный потенциал, рецепторный потенциал, синапти-ческий потенциал. Вслед за ПД возникают не потенциалы, а сначала следовая гиперполяризация, затем — следовая деполяризация. Причем следовые явления возникают после полного восстановления мембранного потенциала до исходного уровня, но не как результат замедления фазы реполяризации, являющейся одной из фаз ПД. В сердечной и гладкой мышцах тоже наблюдается замедленная реполяризация, но на более высоком уровне — плато.
Следовая гиперполяризация клеточной мембраны обычно является следствием еще сохраняющейся повышенной проницаемости клеточной мембраны для К+, она характерна для нейронов. Активационные ворота К-каналов еще не полностью закрыты, поэтому К+ продолжает выходить из клетки согласно концентрационному градиенту, что и ведет к гиперполяризации клеточной мембраны. Постепенно проницаемость клеточной мембраны возвращается к исходной (натриевые и калиевые ворота возвращаются в исходное состояние), а мембранный потенциал становится таким же, каким он был до возбуждения клетки. Na/K-помпа непосредственно за фазы потенциала действия не отвечает, хотя она и продолжает работать во время развития ПД: ионы перемещаются с огромной скоростью согласно концентрационному и частично электрическому градиентам. Возможно К+-помпа способствует развитию следовой гиперполяризации. В некоторых клетках, например в тонких немиелинизированных нервных волокнах (болевых афферентах) хорошо выражена длительная следовая гиперполяризация. Она обеспечивается работой Na/K-насоса, активируемого процессом возбуждения (накопившимся в клетке Na+: на каждые 2К+, возвращаемые в клетку, выводится 3Na+ из клетки). Если блокировать выработку энергии, то эта гиперполяризация исчезает.
Следовая деполяризация также характерна для нейронов, она может быть зарегистрирована и в клетках скелетной мышцы. Механизм следовой деполяризации изучен недостаточно. Возможно, Это связано с кратковременным повышением проницаемости клеточной мембраны для Na+ и входом его в клетку согласно концентрационному и электрическому градиентам.
Исследование ионных токов. Запас ионов в клетке
ПД обусловлен циклическим процессом входа Na+ в клетку (восходящая часть пика) и последующим выходом К+ из клетки (нис-°Дящая часть ПД), что является, в свою очередь, следствием активации и инактивации Na- и К-каналов, т.е. изменением проницаемости клеточной мембраны.
Наиболее распространенным методом изучения функций ионных каналов является метод фиксации напряжения (voltage-clamp). Мембранный потенциал с помощью подачи электрического напряжения изменяют и фиксируют на определенном уровне, затем клеточную мембрану градуально деполяризуют, что ведет к открытию ионных каналов и возникновению ионного тока, который мог бы деполяризовать клетку. Однако при этом пропускается электрический ток, равный по величине, но противоположный по знаку ионному току, поэтому трансмембранная разность потенциалов не изменяется. Это дает возможность изучить величину ионного тока через мембрану. Применение различных блокаторов ионных каналов дает дополнительную возможность более глубоко изучить свойства каналов.
Количественное соотношение между ионными токами по отдельным каналам в покое клетки, во время ПД и их кинетику можно выяснить с помощью метода локальной фиксации потенциала (patchclamp). К мембране подводят микроэлектродприсоску (внутри его создается разрежение) и, если на этом участке оказывается канал, исследуют ионный ток через него. В остальном методика подобна предыдущей. И в этом случае применяют специфические блокаторы каналов. В частности, при подаче на мембрану фиксированного деполяризующего потенциала было установлено, что через Na-каналы может проходить и К , но его ток в 10 — 12 раз меньше, а через К-каналы может проходить Na , его ток в 100 раз меньше, чем К+. В гладкомышечных клетках в генезе восходящей части ПД ведущую роль играет Са2+, поступающий в клетку; в кардиомиоцитах Са2+ играет важную роль в развитии плато ПД.
Запас ионов в клетке, обеспечивающих возникновение возбуждения (ПД), огромен. Концентрационные градиенты ионов в результате одного цикла возбуждения практически не изменяются. Клетка может возбуждаться до 5-Ю5 раз без подзарядки, т.е. без работы Na/K-насоса. Число импульсов, которое генерирует и проводит нервное волокно, зависит от его толщины, что определяет запас ионов. Чем толще нервное волокно, тем больше запас ионов, тем больше импульсов оно может генерировать (от нескольких сот до нескольких сотен тысяч) без участия Na/K-насоса. Однако в тонких С-волокнах на возникновение одного ПД расходуется около 1 % концентрационных градиентов Na+ и К+. Если заблокировать выработку энергии, то клетка будет еще многократно возбуждаться и в этом случае. В реальной же действительности Na/K-насос постоянно переносит Na+ из клетки, а К+ возвращает в клетку, в результате чего постоянно поддерживается концентрационный градиент Na и К+, что осуществляется за счет непосредственного расхода энергии, источником которой является АТФ. Имеются данные, что увеличение внутриклеточной концентрации Na+ сопровождается увеличением интенсивности работы Na/K-насоса. Это может быть связано исключительно с тем, что для переносчика становится доступно большее количество внутриклеточного Na+.
Локальный потенциал. Оценка проницаемости клеточной мембраны
Локальный потенциал. При раздражении возбудимой ткани не всегда возникает ПД. В частности, если сила раздражителя мала, деполяризация не достигнет критического уровня, естественно, не возникнет импульсное, т.е. распространяющееся, возбуждение. В этом случае ответ ткани на раздражение будет иметь форму локального потенциала. Локальными потенциалами возбудимых клеток также являются: возбуждающий постсинаптический потенциал, рецепторные потенциалы, тормозной постсинаптический потенциал. Величина локальных потенциалов весьма вариабельна, она может достигать 10 — 40 мВ в зависимости от рода клеток и силы стимула. Свойства такого ответа существенно отличаются от импульсного.
Повышение возбудимости клетки во время локального потенциала объясняется тем, что клеточная мембрана оказывается частично деполяризованной. Если Екр остается на постоянном уровне, то для достижения критического уровня деполяризации во время локального потенциала нужен значительно меньшей силы раздражитель. Кроме того, при частичной деполяризации клеточной мембраны начинают активироваться Na-каналы. Амплитуда ПД не зависит от силы раздражения, потому что он возникает вследствие регенеративного процесса.
Состояние проницаемости клеточной мембраны можно определить по скорости движения ионов в клетку или из клетки согласно концентрационному градиенту, т.е. по проводимости ионов Na+ и К+ (gNa и gK), но при условии, что влияние электрического градиента на движение ионов исключено или оно постоянное. Последнее условие выполняется с помощью методики фиксации напряжения (voltage-clamp) на постоянном уровне. Ток Na+ в клетку при деполяризации быстро нарастает и начинает падать уже через 0,5 мс. Ток К+ нарастает медленно и приближается к максимальной величине к тому времени, когда ток Na+ возвращается к нулю. Причем выход К+ из клетки при всех уровнях деполяризации возникает с задержкой, возрастает с увеличением деполяризации мембраны, достигает максимума примерно через 1,5 мс, после чего начинает падать и к 3 мс приближается к исходному уровню.
На пике потенциала действия gNa начинает падать, в то время как gK продолжает медленно увеличиваться, обусловливая фазу реполяризации. В обычных условиях мембранные токи при данных концентрационных градиентах зависят не только от проницаемости клеточной мембраны, но и от мембранного потенциала, точнее — от электрического градиента. Ионные токи могут точно характеризовать изменения gNa и gK только при постоянном мембранном потенциале. В состоянии покоя соотношение констант проводимости ионов K+:Na+:Cl~ равно 1:0,04:0,45, а во время фазы деполяризации ПД: 1:20:0,45, из чего следует, что проницаемость мембраны для К+ и СГ во время фазы деполяризации и восходящей фазы инверсии не изменяется. Это хорошо согласуется с общепринятыми представлениями о механизме возникновения ПД: Na+ движется в этот период внутрь клетки; затем проницаемость клеточной мембраны повышается для К+, что и определяет причину реполяризации — выход К+ из клетки. Проницаемость клеточной мембраны для ионов СГ во время развития потенциала действия не изменяется. Естественно, ион СГ в возникновении ПД участия не принимает.
Изменения возбудимости клетки во время ее возбуждения. Лабильность
Возбудимость клетки во время ее возбуждения быстро и сильно изменяется. Различают несколько фаз изменения возбудимости, каждая из которых строго соответствует определенной фазе ПД и так же, как и фазы ПД, определяется состоянием проницаемости клеточной мембраны для ионов.