Принципы биохимического исследования (стр. 2 из 6)

Таким образом, при низких значениях рН аминокислота находится в катионной форме, а при высоких — в анионной. При некотором промежуточном значении рН аминокислота оказывается незаряженной и называется цвиттерионом. Было установлено, что в кристаллическом состоянии или после растворения в чистой воде такие аминокислоты существуют главным образом в виде цвиттерионов, что придает им свойства ионных соединений, а именно высокую точку плавления и кипения, хорошую растворимость в воде и плохую растворимость в таких органических растворителях, как эфир и хлороформ. Величина рН, при которой в водном растворе преобладает цвиттерион, называется изоионной точкой: число отрицательных зарядов, образующихся на молекуле в результате отщепления протонов, равно числу положительных зарядов, образующихся благодаря присоединению протонов. Для аминокислот эта величина приблизительно соответствует изоэлектрической точке (pi) — молекула не несет суммарного заряда и таким образом оказывается электрофоретически неподвижной. Численное значение рН для этого случая зависит от того, насколько сильной является кислота, и определяется следующим уравнением:

Для глицина величины рКа, Н рКа_г равны 2, 3 и 9,6 соответственно; следовательно, изоионная точка равна 6,0. При более низких значениях рН в растворе содержатся и цвиттерион, и катион, а соотношение между ними определяется уравнением Гендерсона — Хассельбальха; при более высоких рН наряду с цвиттерионом в растворе находится анион.

Для так называемых «кислых» аминокислот, например, аспарагиновой кислоты; ионизация носит несколько иной характер. Это обусловлено наличием у них второй карбоксильной группы.

В этом случае рН, при котором в водном растворе преобладает цвиттерион, определяется величинами рС_а, и рК_аз

Для лизина, который является «основной» аминокислотой, изоионная точка определяется величинами рКа₂ и рКа₃- Ионизация происходит следующим образом:

Вместо второй амино- или карбоксильной группы боковая цепь аминокислоты иногда содержит другую химическую группу, которая при определенном значении рН также ионизуется. К таким группам относятся фенольная (тирозин), гуанидиновая (аргинин), имидазольная (гистидин) и сульфгидрильная группа (цистеин). Ясно, что степень ионизации различных основных групп аминокислот при одном и том же рН будет различной. Более того, небольшие различия могут наблюдаться даже у одной и той же группы. Эти различия используют при электрофоретическом и ионообменном разделении смесей аминокислот, имеющихся, например, в белковом гидролизате.

Ионизация молекул белка качественно напоминает ионизацию аминокислот, но в количественном отношении отличается от нее благодаря наличию большого числа способных к ионизации групп. Белки образуются путем конденсации а-аминогруппы одной аминокислоты с о-карбоксильной группой соседней аминокислоты, поэтому, за исключением двух концевых аминокислот, все о амино- и карбоксильные группы участвуют в образовании пептидных связей и в белке не ионизуются. Однако в боковых цепях присутствуют сотни амино- и карбоксильных групп, которые могут легко ионизоваться. Электростатическое притяжение, возникающее между некоторыми из этих групп, способствует стабилизации третичной структуры белковой молекулы, при этом молекулы белков часто бывают свернуты таким образом, что большинство способных к ионизации групп оказываются расположенными на поверхности молекулы, где они могут вступать во взаимодействие с окружающей средой. Естественно, что относительное число положительно и отрицательно заряженных групп в молекуле белка определяет те или иные ее физические свойства. У гистонов преобладают катионные группы, в то время как в других белках количество анионных и катионных групп либо одинаково, либо, напротив, преобладают анионные группы.

В отличие от аминокислот у белков изоионная точка обычно не совпадает с изоэлектрической. По определению изоионная точка — это такая величина рН, при которой молекула белка содержит равное число положительно и отрицательно заряженных групп, образовавшихся в результате связывания основных групп с протонами и соответствующей диссоциации кислотных групп. Изоэлектрическая точка — это рН, при котором белок электрофоретически неподвижен. При ее определении белок растворяют в буферном растворе. В этом растворе всегда содержатся низкомолекулярные анионы и катионы, способные связываться с многочисленными заряженными группами белка. В таких условиях наблюдаемое в изоэлектрической точке равновесие зарядов частично обусловлено их компенсацией связавшимися с молекулой белка анионами и катионами.

Молекулы белка всегда изучают в буферных растворах; при этом важно установить изоэлектрическую точку, поскольку, на пример, именно при этом значении рН создаются наиболее благоприятные условия для взаимодействия между противоположно заряженными группами соседних молекул, что ведет к их последующей агрегации и быстрому осаждению.

Агрегацию, а следовательно, и осаждение белковых молекул можно вызвать добавлением к раствору белка солей, например сульфата аммония. Молекулы белка и неорганические ионы при гидратации конкурируют за молекулы воды, и по достижении определенной концентрации соли взаимодействия белок — белок начинают преобладать над взаимодействиями белок — вода, что приводит к агрегации, а затем и осаждению белка. Этот метод широко применяется на начальных стадиях очистки белков. Различия в изоэлектрической точке разных белковых молекул используются при разделении белков с помощью электрофореза.

2. Подходы к биохимическому исследованию

Как мы уже говорили, активность клетки зависит от взаимодействия ее как с непосредственным окружением, так и с клетками, значительно удаленными от нее; кроме того, играет роль также и то, какие методы применяются для ее изучения. Поэтому чтобы получить наиболее полное представление о состоянии клеток внутри органов и тканей, опыты лучше всего проводить на интактных изолированных органах и тканях. Преимущество такого изучения заключается в том, что при этом удается избежать нежелательных эффектов, обусловленных изменением непосредственного тканевого окружения, как это имеет место, например, при фракционировании клеток. Исследование на уровне целых организмов не только не нарушает целостности тканей, но позволяет изучать отдельные органы и ткани, оставляя без изменения снабжение их питательными веществами, нервную и гормональную регуляцию и т. д. Таким образом, чтобы получить полную картину клеточного обмена, необходимо провести исследование на целом организме, изолированном органе, на уровне клетки, клеточной органеллы, на молекулярном и атомном уровнях.

На рис. 1.1 показаны пути биохимических подходов к изучению возможных превращений какого-либо экзогенного соединения (ксенобиотика) в организме животного или его действия на этот организм. Существуют два подхода, которые взаимно дополняют друг друга.

Первый из них заключается в том, что животному вводят соединение, а затем выделяют и идентифицируют все продукты, выводимые из организма. В других случаях спустя некоторое время после введения соединения животное умерщвляют, выделяют и фракционируют нужный орган или ткань, а затем изучают судьбу введенного соединения или исследуют его действие на интересующую субклеточную систему.

Второй подход состоит во введении соединения на одном из указанных на рис. 1.1 уровнях (т. е. в соответствующий изолированный орган, гомогенат, органеллу или субклеточную систему) и изучении действия этого соединения или путей его превращения на данном или более низких уровнях.

Действие какого-либо соединения можно исследовать на нескольких клеточных частицах или органеллах, каждую из которых необходимо для этого выделить из системы и подвергнуть анализу.

Зачастую исследуемое соединение представляет собой природный метаболит или входит в состав самого организма, а иногда является изотопом составного компонента организма. С другой стороны, не всегда действие какого-либо экзогенного соединения на функционирование организма представляет интерес для биохимика. В любом случае изучение можно проводить на любом из вышеуказанных уровней организации, а получаемые на каждом уровне результаты помогают составить более полное представление о процессах, протекающих в организме.

3. Исследования на уровне целого организма

Биохимические эксперименты на животных могут быть предприняты с различными целями. Применяя в течение длительного времени специальную диету, лишенную определенных витаминов или микроэлементов, и одновременно регистрируя возникающие при этом физиологические и клинические изменения, можно исследовать метаболическую роль данного витамина или микроэлемента. Вместе с тем, вводя животному какое-либо экзогенное соединение, можно изучать как влияние этого соединения на организм животного (фармакологическая или патологическая ответная реакция), так и влияние организма на введенное соединение, т. е. его превращения и выведение. В последнее время, главным образом благодаря созданию комитета Данлопа (ныне Комитет по безопасности применения лекарственных средств) после известной трагедии с талидомидом, все большее внимание стали уделять вопросам о том, каким образом различные лекарственные вещества, пищевые добавки и красители, а также такие соединения, как ДДТ, накапливаются в пище и метаболизируются, где они локализуются, какое разрушающее действие оказывают на органы и ткани и какие тератогенные и канцерогенные побочные эффекты могут вызывать.