Антиоксидантная система при внутриутробной гипоксии плода (стр. 4 из 6)
Каталаза — фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. При низкой концентрации перекиси каталаза проявляет также пероксидазную активность, окисляя низшие спирты, полифенолы. Одной из основных функций каталазы является защита клеточных мембран от пероксида водорода, образующегося при перекисном окислении липидов [29].
Таким образом, при патологически протекающей беременности наблюдается дисбаланс в системе ПОЛ-АОС. При активации свободно-радикальных процессов на фоне снижения антиоксидантной активности риску повышенной окислительной модификации подвергаются не только липиды, но и белки. В связи с этим вызывает интерес изучение показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в плаценте при ХВГП.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
Активность катепсина D, содержание пептидов средней молекулярной массы, активность каталазы, церулоплазмина, уровень продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых коньюгатов), уровень гидроперекисей определяли в плацентарной ткани, которую получили сразу после родов. Для исследования брали наиболее удаленную от места прикрепления пуповины ткань. Плацентарную ткань помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от крови и высушивали фильтровальной бумагой. Ткани взвешивали, навески гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком.
2.1.1. Клинические группы
Было обследовано 16 образцов плацентарной ткани женщин в возрасте от 20 до 40 лет.
Все родильницы были разделены на 2 группы (рис. 1). Первая группа – женщины с физиологическим течением беременности и родов (n =8), вторая группа – женщины с хронической внутриутробной гипоксией плода (n=8).
Клинические группы
норма ХВГП
Рис. 1. Клинические группы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод определения активности катепсина D
Для определения активности катепсина D использовали 7,5%-ый гомогенат ткани на натрий-ацетатном буфере (рН 3,3). Препарат фермента (20 мкл) смешивали с 60 мкл 100 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 3,3) и преинкубировали 8 мин при температуре 37°С. Начинали реакцию прибавлением в опытные пробы 20 мкл 8% раствора гемоглобина, полученного из бычьей крови. Реакцию останавливали через 40 мин прибавлением 100 мкл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. В контрольные пробы добавляли 20 мкл 8% раствора гемоглобина. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. После центрифугирования отбирали 100 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося тирозина методом Лоури. Пробы колориметрировали на КФК-2 при λ=750 нм. Активность фермента определяли как разность в оптической плотности между опытными и контрольными пробами. Активность фермента выражали в нмоль тир, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли методом Лоури.
2.2.2. Метод определения количества пептидов средней молекулярной массы
Для определения количества пептидов средней молекулярной массы использовали 5%-ый гомогенат ткани. Белки исследуемой биологической жидкости осаждали равным объемом 0,6 М раствора хлорной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость нейтрализовали 3М раствором К2СО3 из расчета 0,2 мл на 1 мл супернатанта. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Нейтрализованный супернатант разводили в 5 раз. После центрифугирования отбирали 0,5 мл нейтрализованного разведенного супернатанта, в котором определяли количество пептидов средней молекулярной массы методом Лоури. Содержание пептидов средней молекулярной массы выражали в мкг/мл.
2.2.3. Метод определения активности каталазы
Активность каталазы выражается каталазным числом – количеством мг перекиси водорода, которое может разложить 1 мкг крови (гомогената).
В две колбы наливали по 7 мл дистиллированной воды и добавляли в них по 1 мл гомогената. Содержимое контрольной пробы кипятили 2 - 3 мин. В обе колбы вносили по 2 мл 1% раствора H2O2 и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем приливали по 5 мл 10% H2SO4 и оттитровывали содержимое колб 0,05н раствором KMnO4 до розового цвета.
Расчет: 1мл 0,05 н KMnO4 соответствует 0,85 г H2O2. Таким образом, разницу в результатах титрования контроля и опыта умножаем на эту величину и получаем количество мг перекиси водорода, которое может разложить 1 мкл гомогената.
2.2.4. Метод определения активности церулоплазмина
Активность церулоплазмина определяли модифицированным методом Ревина, который базируется на окислении p-фенилендиамина при участии этого фермента. Ферментативную реакцию останавливают добавлением фтористого натрия. По оптической плотности образующихся продуктов судят о концентрации церулоплазмина.
В пробирки вносили по 0,1 мл гомогената. В контрольную пробу добавляли 2 мл раствора NaF (с целью инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем в контроль и опыт добавляли по 8 мл ацетатного буфера и по 1 мл р-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивали и инкубировали 1 час при температуре, равной +370С.
После инкубации во все пробирки, за исключением контрольной, доливали по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивали и переносили в холодильник, где выдерживали в течение 30 минут при +40С.
Пробы колориметрировали на КФК-2 при λ=530 нм. Результаты сравнивали с данными контрольной пробы. Значение оптической плотности умножали на коэффициент пересчета 875.
2.2.5. Метод определения содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых коньюгатов)
Для экстракции липидов брали 1 мл 25% гомогената плацентарной ткани, приливали 3 мл метанола, перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 минут, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Добавляли 3 мл гексана, вновь тщательно перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 минут и оставляли отстаиваться на 30 минут.
После разделения слоев, верхний (метанол – гексановый слой) отбирали в сухую пробирку и использовали для исследований.
Уровень диеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм, кетодиенов и сопряженных триенов – 278 нм, ненасыщенных липидов – 220 нм. Рассчитывали содержанимое диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов по отношению к уровню ненасыщенных липидов (E233/E220 и Е278/Е220).
2.2.6. Метод определения содержания гидроперекисей
Для приготовления гомогената использовали буфер 0,025 н трис-HCl (pH 7,4), содержащий 0,175 м KCl. В центрифужные пробирки помещали по 2 мл 25% гомогената и осаждали белки добавлением 0,2 мл 50% раствора ТХУ.
Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течении 10 минут при 4000 об/мин. Далее 2 мл надосадочной жидкости доводили 96% этанолом до 27 мл, прибавляли 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-го раствора соли Мора в 3%-ной HCl, пробы интенсивно встряхивали. Через 30 секунд приливали 1 мл 20%-го раствора роданистого калия, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля использовали пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо надосадочной жидкости. Измерение оптической плотности проводили в течение 10 минут после добавления роданистого калия при λ=480 нм.
2.2.7. Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с помощью программы Статистика (версия 6.0).
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Активность катепсина D в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Результаты исследования показали достоверное повышение активности катепсина D плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода. Отмечено повышение активности фермента при патологии в 1,8 раз по сравнению с нормой (рис.2).
Рис.2. Активность катепсина D в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
Повышение активности катепсина D плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода может быть связано с нарушением структурно-функциональных свойств клеточных мембран плаценты при изучаемой патологии.
3.2. Количество пептидов средней молекулярной массы в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Согласно результатам исследования при хронической внутриутробной гипоксии плода содержание пептидов средней молекулярной массы в плацентарной ткани повышалось в 1,86 раза по отношению к норме (рис. 3).
Рис. 3. Содержание пептидов средней молекулярной массы в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (мкг/мл; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)
Повышение содержания пептидов средней молекулярной массы может быть связано с повышением активности катепсина D[14].
3.3. Активность каталазы в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода
Результаты исследования показали достоверное понижение активности каталазы в плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода в 1,46 раза по отношению к норме (рис. 4).