Лекарственные препараты, получаемые биотехнологическими методами. Ферменты (стр. 2 из 4)

Биотехнологическое производство ферментов реализуется двумя способами – поверхностным и глубинным. Твердофазная поверхностная ферментация заключается в выращивании продуцента на поверхности тонкого слоя твердой сыпучей среды. Глубинная ферментация в жидкой среде может быть реализована как в условиях периодического процесса, так и с применением проточных систем. [1]

3 Промышленные названия препаратов ферментов

Препараты ферментов, вырабатываемые промышленностью, кроме основного фермента (комплекса ферментов) содержат различные балластные вещества. Название ферментных препаратов складывается из сокращенного названия основного фермента и видового названия микроорганизма-продуцента. Например, препарат, содержащий в своей основе амилолитические ферменты и полученный при помощи культуры Aspergillus oryzae, называется амилоризин. В названии препарата указывается также способ культивирования и степень концентрирования и очистки:

Амил ори зин Г 10Х

IIIIII IV V

I – название основного фермента; II – название микроорганизма-продуцента; III – окончание; IV – способ культивирования:

"П" – поверхностный, "Г" – глубинный; V – степень очистки (концентрирования):

"Х" – поверхностная культура или культуральная жидкость;

"2Х" – концентрированные растворы ферментов, освобожденные от биомассы;

"3Х" – высушенные препараты "2Х";

"10Х" – осажденные органическими растворителями и солями;

"15Х" –"30Х" – очищенные от балластных веществ и других ферментов с использованием различных методов очистки и фракционирования. [2]

4 Твердофазная поверхностная ферментация

Основные параметры процесса приведены в таблице 2 [3]:

Таблица 2. Основные параметры твёрдофазной поверхностной ферментации

Параметры стадии	Значения параметров
Продуценты	Микроскопические грибы родов Aspergillus,Rhizopus, Penicillium, Trichoderma, Mucor, Fusarium
Компоненты питательной среды	Пшеничные отруби, солодовые ростки,свекловичный жом, пивная дробина, опилки (W = 58…60 %)
Температура культивирования	30…32 → 28…30 °С
Режим аэрации	Кондиционированный воздух W от 98…99 до92…94 % и температурой от 30…32 °С до 28…30 °С, расход 0,1…0,2 м3 / кг⋅ч
Продолжительность культивирования	От 36 до 52 ч в зависимости от продуцента
Содержание ферментов	0,006…0,007 % от массы сухих веществ

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования.

Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной материал может быть трёх видов:

- культура, выросшая на твердой питательной среде;

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды. [14]

Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов.

Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).

Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к следующему:

· освобождение от нерастворимых веществ;

· освобождение от сопутствующих растворимых веществ;

· фракционирование (как правило, хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.

Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.

Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов. [10]

Технологическая схема поверхностной ферментации представлена на схеме:

5 Метод глубинной фементации

Таблица 3 Условия проведения глубинной ферментации

Параметры стадии	Значения параметров
Продуценты	Микроскопические грибы родов Aspergillus,Rhizopus, Penicillium, Trichoderma, Mucor,Fusarium, бактерииродов Baccillus и Clostridium
Компонентыпитательной среды	Кукурузная мука, крахмал, патока, гидролизатыказеина, дрожжей, древесины, минеральные соли(содержание СВ от 1,5 до 15,5, pH от 3,5 до 8,5)
Температуракультивирования	26…32 °С для грибов32…37 для бактерий
Режим аэрации	50…60 м3 / ч*м3
Продолжительностькультивирования	От 24 до 54 ч

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.[13]

Для засева питательной среды материал готовят также глубинным методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5-20%). Если же происходит обильное спороношение - сокращается до 1%.