Таким образом, присутствие ионов Ca2+ в среде может способствовать тепловой дестабилизации КП Н, а также агрегации ее в проводящих путях комплекса Гольджи и освобождению из клетки.
Ген КП Н был клонирован и секвенирован [48, 187, 232]. Транскрипция КП Н осуществляется с единственного сайта транскрипции [250]. мРНК КП Н состоит из 2100 нуклеотидов [114].
КП Н синтезируется в виде предшественника с Mr 75 кДа, состоящем из 476 аминокислотных остатков [154, 232, 254] (у морского черта Lophius americanus – из 454 [184]). Он, предположительно, содержит сигнальный пептид. Затем проКП Н с Mr 65-75 кДа подвергается посттрансляционному С- и N-концевому [133, 149, 232]. Этот процесс идет в секреторных везикулах под действием прогормон-конвертазоподобного фермента [116, 253].
Во всех органах и тканях КП Н представлена в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. Обе формы являются гликопротеинами, имеют сходные свойства (идентичную субстратную специфичность и чувствительность к групп-специфичным реагентам) и отличаются активностью (растворимая более активна). Mr мембранной формы 55-57 кДа, Mr растворимой формы 53-57 кДа [15, 17, 89, 98, 132, 134, 147, 153, 154, 259, 262, 281].
Следует отметить, что с повышением рН мембраносвязанная форма становится неустойчивой и переходит в растворимую. По-видимому, это связано с комбинированными полярными и гидрофобными взаимодействиями карбоксильного конца пептида [115, 134]. Имеются сведения о том, что мембранная форма кп н (57 кДа) связана с эндоплазматическим ретикулумом и элементами комплекса Гольджи, а растворимая форма кп н (54 кДа) – с секреторными гранулами [133]. Соотношение мембраносвязанной и растворимой форм КП Н в разных клетках и тканях отличается. В частности, в клетках линий RIN 1046-38 и RIN 1046-44 75% зрелой КП Н обнаружено в мембраносвязанной форме [107]. С другой стороны, в передней и задней долях гипофиза 70% всей активности КП Н представлено растворимой формой [222].
В настоящее время обнаружено несколько видов мембраносвязанной и растворимой форм фермента, отличающихся по молекулярной массе. В растворимой фракции очищенных секреторных гранул, содержащих инсулин, выявлена форма КП Н с Mr 55 кДа [89]. В передней доли гипофиза обнаружено две формы КП Н – с Mr 56 и 53 кДа, а в задней – только форма с Mr 53 кДа. Эти формы имеют сходные каталитические свойства [222, 223]. Различия в молекулярной массе мембраносвязанной и растворимой форм КП Н, по-видимому, связано с наличием у первой, так называемого ”мембранного якоря”. С-концевая область мембраносвязанной КП Н (51 аминокислотный остаток) образует амфифильную a-спираль, которая и может служить гидрофобным ”мембранным якорем” [105, 206, 271]. С другой стороны, D. Parkinson [222, 223] высказывает сомнения относительно возможности перехода мембраносвязанной формы в растворимую посредством С-концевого протеолиза.
Уровни мРНК КП Н и активности КП Н в мозге и тканях в целом коррелируют между собой [66, 114]. мРНК КП Н и ферментативная активность обнаружена в клонах эндокринных клетках – AtT-20, GH-3, GH4C1 и неэндокринных – L, 3T3, SK-HEP-1, HEK293, COS, C127 [100, 163]. Наивысшие уровни мРНК КП Н обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КП Н у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга [183].
Высокая экспрессия мРНК КП Н отмечена в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса – местах преимущественного синтеза окситоцина и вазопрессина [72]. Обнаружено увеличение концентрации мРНК КП Н при увеличении содержания этих двух пептидов [72]. В то же время, в других зонах мозга с высоким уровнем нейропептидов не наблюдается изменений уровня мРНК КП Н при осмотической стимуляции [72].
Отделы мозга отличаются по уровню активности КП Н более чем в 10 раз. Распределение активности этой карбоксипептидазы в целом соответствует распределению нейропептидов [18, 25, 122, 182]. Максимальная активность растворимой формы фермента обнаружена в гипофизе: в передней доли – в 20 раз больше, чем в задней [122, 180, 222, 256, 262]. Далее по мере снижения активности следуют стриатум, гиппокамп, кора больших полушарий, таламус с гипоталамусом, средний мозг и мозжечок [256]. При этом в гипоталамусе высокая активность КП Н обнаружена в медиальном возвышении, супраоптическом, паравентрикулярном и супрахиазматическом ядрах [180]. Супраоптическое ядро (богатое телами нейронов) содержит, в основном, неактивную 65 кДа форму КП Н. Срединное возвышение и гипофизарная ножка – богатые аксонами области – содержат формы КП Н как с Mr 65 кДа, так и с Mr 55 кДа. Нервные окончания задней доли гипофиза содержат, в основном, форму КП Н с Mr 55 кДа [149]. В стриатуме высокое содержание имуннореактивной КП Н отмечено в стриасомах (клетках богатых веществом Р) [81, 225]. В гиппокампе КП Н обнаружена в пирамидальных клетках и во внутренней части молекулярного слоя зубчатой извилины. Фермент также обнаружен в центральных нейронах миндалины [180]. Кроме этого, активность КП Н обнаружена в сердце – правом и левом предсердиях (активность в тканях желудочков очень низкая) [181, 182]. Имеются сведения о наличии активности КП Н в водянистой жидкости глаза человека [220]. Тканевое и региональное распределение КП Н сходно у разных видов животных (например, у быка, крысы, мыши, акулы, Xenopus и Aplysia) и человека [117, 165].
В клетке КП Н локализована, в основном, в секреторных гранулах, причем часто совместно с биологически активными пептидами – инсулином [133], глюкагоном [6, 253], энкефалинами [46, 49], АКТГ [54], вазопрессином [57], окситоцином [58], веществом P [59], атриальным натрийуретическим фактором [38].
Следует отметить, что уровень мРНК КП Н способен быстро изменяться в ответ на внешние воздействия. В частности, уровень мРНК КП Н повышается в ганглионарных клетках сетчатки глаза сразу после смены условий освещенности, особенно при смене темноты на свет. Однако в это же время снижается количество самого белка КП Н. В темноте КП Н экспрессируется в фоторецепторных клетках. На свету экспрессия КП Н резко индуцируется в ганглионарных клетках сетчатки глаза, а в фоторецепторных клетках экспрессия снижается [237].
Уровень мРНК КП Н увеличивается под действием галоперидола в промежуточной и задней долях гипофиза; в клетках PC12 (клеточная линия феохромоцитомы крыс) – под влиянием фактора роста нервов [87, 131, 172, 221, 268]. Короткое (1-3 ч) воздействие 50 мМ раствора KCl стимулирует секрецию КП Н клетками РС12 без синтеза белка фермента. Пролонгированное (24-48 ч) действие раствора KCl стимулирует секрецию КП Н без изменения внутриклеточного уровня КП Н. При этом уровень мРНК КП Н не изменяется после 2-х часов воздействия, увеличивается на 35% после 5 часов и на 75% после 24-72 часов воздействия [87].
В клетках GH4C1 (из переднего гипофиза крысы, продуцирующие пролактин) 50 мМ раствор KCl увеличивает секрецию КП Н и пролактина в 10 раз, а 100 мМ тиреотропин-рилизинг фактор – в 2-3 раза [119]. Кроме того, эстрадиол (1 нМ), инсулин (300 нМ) и фактор роста эпидермиса (10 нМ) увеличивают внутриклеточный уровень КП Н в 2 раза по сравнению с контролем. Km при этом не изменяется, но увеличивается Vmax [119].
Бромкриптин вызывает снижение уровня мРНК КП Н в промежуточной доли гипофиза [221].
C. Rodriguez и соавт. обнаружили, что действие дексаметазона на клетки AtT-20 снижает уровень мРНК КП Н и мРНК проопиомеланокортина примерно на 30% [232]. С другой стороны, прибавление кортикотропин-рилизинг фактора к клеткам, которые подвергались воздействию дексаметазона, вызывает 2-3-х кратное увеличение уровня мРНК КП Н и мРНК проопиомеланокортина [232]. Авторы считают, что уровни мРНК проопиомеланокортина и мРНК КП Н согласованно регулируются кортикотропин-рилизинг фактором и стероидными гормонами. При действии кортикотропин-рилизинг фактора на клетки AtT-20, не подверженные действию дексаметазона, происходит возрастание активности КП Н [186].
При хроническом прибавлении дексаметазона, кортикостерона, кортикотропин-рилизинг фактора, соматостатина к клеткам линии AtT-20/D16v уровень мРНК КП Н и активность КП Н не изменяются [186, 265].
При внутрибрюшинном введении дексаметазон и гидрокортизон (в дозах 1 и 100 мг на кг массы тела, соответственно) снижают активность растворимой и мембраносвязанной формы КП Н в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс, но динамика влияния во времени отличается [10]. В изученные интервалы (0,5, 4 и 24 часа после инъекции) дексаметазон сильнее подавляет активность в начальный период, тогда как действие гидрокортизона более выраженно через 24 часа после введения. In vitro дексаметазон и гидрокортизон не оказывают влияния на активность КП Н [10]. Авторы предполагают, что снижение активности КП Н in vivo происходит за счет снижения синтеза мРНК КП Н.
Smith D.R. и соавт. [250] предполагают, что экспрессия гена КП Н регулируется тиреоидными гормонами. В частности, они установили, что экспрессия гена КП Н в переднем гипофизе крыс стимулируется при системном недостатке тиреоидных гормонов.
С возрастом у самцов крыс активность КП Н изменяется следующим образом. У эмбрионов мРНК КП Н экспрессируется как в нервной (таламус, гипоталамус, средний и продолговатый мозг, кортикальная пластинка и спинной мозг, а также периферические ганглии), так и в других тканях (сердце и первичные хрящи) [283]. В постнатальном периоде практически во всех отделах мозга, в частности в гипофизе и гипоталамусе, а также в надпочечниках, активность данного фермента повышалась со дня новорожденности до 30-го дня постнатального периода. У 90-дневных самцов отмечено некоторое снижение активности КП Н. Наибольшая активность исследуемого фермента обнаружена у 120-дневных крыс. В семенниках активность КП Н снижалась в период со дня новорожденности до 10-го дня, затем повышалась до максимального уровня к 30-му дню постнатального периода. Далее вплоть до 120-дневного возраста, активность этого фермента практически не изменялась [12, 85].