Исследование уровня цитокинов у больных с гнойно воспалительными за (стр. 6 из 11)

■ 10% кислота, маркирована "Стоп-реагент", 1 флакон;

■ раствор тетраметилбензидина, маркирован " ТМБ";

Дополнительные материалы и оборудование:

■ автоматические одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей: от 0,005 до 0,01 мл; от 0,05 до 0,25 мл; от 0,2 до 1 мл; от 1 до 5 мл;

■ одноканальная полуавтоматическая пипетка, позволяющая отбирать объемы жидкости до 0,3 мл.

■ прибор для встряхивания рамки со стрипами (шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебания 3-4мм и частотой 4-6 Гц при комнатной температуре (+16-25°С), либо статируемый шейкер, позволяющий производить встряхивание в том же режиме при температуре +37°С;

■ спектрофотометр, позволяющий измерить оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450нм;

■ цилиндры, позволяющие отмерять 10 и 100 мл;

■ два стеклянных стакана емкостью 20 мл и один - 150 мл;

■ дистиллированная вода.

Принцип работы набора.

В наборе "ИФА-IL-4" использован "сэндвич" вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к интерлейкину-4. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа IL-4, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный IL-4 взаимодействует с конъюгатом вторых антител – биотин. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству IL-4 в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу.

Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация IL-4 в определяемых образцах.

Подготовка реагентов к анализу

· Калибровочные пробы. Во флаконы с калибровочными пробами добавить по 1,0 мл дистиллированной воды, выдержать в течение 20мин. И затем тщательно перемешать до полного растворения, избегая пенообразования. Хранить при температуре +4...6° С в течение трех суток; при возможности более длительного хранения разлить по 220 мкл (чтобы избежать повторного оседания) и хранить при температуре -20° С не более месяца.

· Стрипы. Вскрыть и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в герметично закрытом пакете из фольгированного полиэтилена при температуре

· Сывороточный буфер. В стакан с 480 мл дистиллированной воды добавить содержимое флакона с маркировкой"Буфер Р". Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Xранить промывочный буфер при температуре +2…8°С.

· Буфер А. Готов к использованию. Хранить закрытым при температуре+2…6° С.

· Набор антител анти-IL-4-биотин. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора антител путем смешивания 40 мкл концентрированного антител с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор антител должен быть использован в течение часа, длительному хрипению не подлежит.

· Конъюгат Е. авидин-пероксидаза. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора конъюгата путем смешивания 40 мкл концентрированного конъюгата Е с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор конъюгата Е должен быть использован в течение часа, длительному хранению не подлежит.

· Субстратная смесь приготовляется непосредственно перед употреблением.

· "Стоп-реагент" готов к использованию.

Проведение анализа:

1	Внести во все лунки по 0,1 мл "Буфер А". Расход реагентов в табл.1
2	В соответствующие лунки по 0,1 мл калибровочных проб или исследуемой сыворотки, внесение образцов не должно занимать более 15 мин
3	Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 2 ч со встряхиванием
4	Удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки три раза. При промывке во все лунки добавить по 0,25 мл промывочного буфера
5	На шейкере в течение 5-10 сек с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в положении по фильтровальной бумаге
6	Внести во все лунки по 0,1 мл раствора антител
7	Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 1 часа со встряхиванием
8	Лунки промыть
9	Внести во все лунки по 0,1 мл раствора конъюгата Е
10	Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 30 минут со встряхиванием
11	Лунки промыть
12	Перед окраской стрипы сполоснуть дистиллированной водой для болееполного удаления не связавшего конъюгата
13	Внести во все лунки по 0,1 мл субстратной смеси и инкубировать стрипы в темноте в течение 15-20 мин в зависимости от степени развития окраски
14	Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и субстратнуюсмесь, по 0,05 мл "Стоп-реагента" для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере 5мин
15	Измерить оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм
16	Построить для калибровочных проб графикзависимости оптической плотности в единицах оптической плотности (ОП) от концентрации IL-4 впг\мл.
17	Определить содержание IL-4 в пробах по калибровочному графику

Таблица 2. Расход реагентов для проведения анализа

Количество используемых стриповшт	Буфер Амл	Раствор антителмл	Конъюгатмл	Буфер Рмл	Субстратная смесь
					Раствор ТМБмл	Буфер Смл
2	2	2	2	50	0,4	2
3	3	3	3	75	0,6	3
4	4	4	4	100	0,8	4
5	5	5	5	125	1,0	5
6	6	6	6	150	1,2	6
7	7	7	7	175	1,4	7
8	8	8	8	200	1,6	8
9	9	9	9	225	1,8	9
10	10	10	10	250	2,0	10
11,12	12	12	12	300	2,0	10

Пример калибровочных кривых для каждого конкретного набора приводиться в Паспорте контроля качества (Рис. 6).

Рис. 6. Калибровочная кривая (ОБРАЗЕЦ) для определения ИЛ-4

2.2.2. Метод определения уровня гамма-интерферона в сыворотке крови

Для определения уровня гамма-интерферона использовался метод твердофазного иммуноферментного анализа‚ с использованием набора реактивов "ИФА-IFN-gamma" фирмы ВЕКТОР-БЕСТ. Набор "ИФА-IFN-gamma" предназначен для определения концентрации γИФН в сыворотке крови в клинических, диагностических и научно-исследовательских лабораториях.

Состав набора:

■ комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов с рамкой с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к интерлейкину-4, маркирован "Стрипы с моноклональными антителами";

■ 7калибровочных проб, содержащих известные количества гамма-интерферона – 0; 50; 100; 300; 500; 1000 и 2000пг\мл, лиофилизованные препараты;

■ аналитический буферный раствор, маркирован "Буфер А", 1 флакон;

■ концентрированный раствор антител IFN-gamma-биотин, маркирован "Антитела", 1 флакон;

■ концентрированный раствор конъюгата авидин-пероксидаза, маркирован "Конъюгат Е", 1 флакон;

■ концентрированный буферный раствор для промывок лунок, маркирован "Буфер Р", 1 флакон;

■ субстратный буфер, маркирован "Буфер С", 1 флакон;

■ 10% кислота, маркирована "Стоп-реагент", 1 флакон;

■ раствор тетраметилбензидина, маркирован " ТМБ";

Дополнительные материалы и оборудование:

■ автоматические одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей: от 0,005 до 0,01 мл; от 0,05 до 0,25 мл; от 0,2 до 1 мл; от 1 до 5 мл;

■ одноканальная полуавтоматическая пипетка, позволяющая отбирать объемы жидкости до 0,3 мл.

■ прибор для встряхивания рамки со стрипами (шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебания 3-4мм и частотой 4-6 Гц при комнатной температуре (+16-25°С), либо статируемый шейкер, позволяющий производить встряхивание в том же режиме при температуре +37°С;

■ спектрофотометр, позволяющий измерить оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450нм;

■ цилиндры, позволяющие отмерять 10 и 100 мл;

■ два стеклянных стакана емкостью 20 мл и один - 150 мл;

■ дистиллированная вода.

Принцип работы набора.

В наборе "ИФА-IFN-gamma" использован "сэндвич" вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к гамма-интерферону. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа γИФН, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный γИФН взаимодействует с конъюгатом вторых антител – биотин. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству γИФН в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу.