Исследование уровня цитокинов у больных с гнойно воспалительными за (стр. 7 из 11)

Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация γИФН в определяемых образцах.

Подготовка реагентов к анализу

· Калибровочные пробы. Во флаконы с калибровочными пробами добавить по 1,0 мл дистиллированной воды, выдержать в течение 20мин. И затем тщательно перемешать до полного растворения, избегая пенообразования. Хранить при температуре +4...6° С в течение трех суток; при возможности более длительного хранения разлить по 220 мкл (чтобы избежать повторного оседания) и хранить при температуре -20° С не более месяца.

· Стрипы. Вскрыть и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в герметично закрытом пакете из фольгированного полиэтилена при температуре

· Сывороточный буфер. В стакан с 480 мл дистиллированной воды добавить содержимое флакона с маркировкой"Буфер Р". Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Xранить промывочный буфер при температуре +2…8°С.

· Буфер А. Готов к использованию. Хранить закрытым при температуре+2…6° С.

· Набор антител анти- γИФН-биотин. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора антител путем смешивания 40 мкл концентрированного антител с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор антител должен быть использован в течение часа, длительному хрипению не подлежит.

· Конъюгат Е. авидин-пероксидаза. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора конъюгата путем смешивания 40 мкл концентрированного конъюгата Е с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор конъюгата Е должен быть использован в течение часа, длительному хранению не подлежит.

· Субстратная смесь приготовляется непосредственно перед употреблением.

· "Стоп-реагент" готов к использованию.

Проведение анализа:

1	Внести во все лунки по 0,1 мл "Буфер А". Расход реагентов в табл.1
2	В соответствующие лунки по 0,1 мл калибровочных проб или исследуемой сыворотки, внесение образцов не должно занимать более 15 мин
3	Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 2 ч со встряхиванием
4	Удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки три раза. При промывке во все лунки добавить по 0,25 мл промывочного буфера
5	На шейкере в течение 5-10 сек с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в положении по фильтровальной бумаге
6	Внести во все лунки по 0,1 мл раствора антител
7	Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 1 часа со встряхиванием
8	Лунки промыть
9	Внести во все лунки по 0,1 мл раствора конъюгата Е
10	Инкубировать стрипы при температуре 37°С в течение 30 минут со встряхиванием
11	Лунки промыть
12	Перед окраской стрипы сполоснуть дистиллированной водой для болееполного удаления не связавшего конъюгата
13	Внести во все лунки по 0,1 мл субстратной смеси и инкубировать стрипы в темноте в течение 15-20 мин в зависимости от степени развития окраски
14	Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и субстратнуюсмесь, по 0,05 мл "Стоп-реагента" для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере 5мин
15	Измерить оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм
16	Построить для калибровочных проб графикзависимости оптической плотности в единицах оптической плотности (ОП) от концентрации γИФН впг\мл.
17	Определить содержание γИФН в пробах по калибровочному графику

Таблица 3. Расход реагентов для проведения анализа

Количество используемых стриповшт	Буфер Амл	Раствор антителмл	Конъюгатмл	Буфер Рмл	Субстратная смесь
					Раствор ТМБмл	Буфер Смл
2	2	2	2	50	0,4	2
3	3	3	3	75	0,6	3
4	4	4	4	100	0,8	4
5	5	5	5	125	1,0	5
6	6	6	6	150	1,2	6
7	7	7	7	175	1,4	7
8	8	8	8	200	1,6	8
9	9	9	9	225	1,8	9
10	10	10	10	250	2,0	10
11,12	12	12	12	300	2,0	10

Пример калибровочных кривых для каждого конкретного набора приводиться в Паспорте контроля качества (Рис. Б).

Рис. 7. Калибровочная кривая (ОБРАЗЕЦ) для определения γИФН

2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования

Результаты подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при p<0,05 [Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа,1990.352с.].

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

До недавнего времени в России изучением цитокинов занимались немногочисленные группы исследователей, так как биологические методы исследования очень трудоёмки, а импортные иммунохимические наборы весьма дороги. С появлением доступных отечественных иммуноферментных наборов все больший интерес к изучению цитокинового профиля проявляют практикующие врачи.

В настоящий момент диагностическая значимость оценки уровня цитокинов заключается в констатации самого факта повышения или понижения их концентрации у данного больного с конкретным заболеванием. Причём для оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания целесообразно определять концентрацию как противо-, так и провоспалительных цитокинов.

Известно‚ что цитокинам принадлежит важная роль в генезе развития воспалительной реакции при ГВЗ.В частности‚ ИЛ-4 – антивоспалительный цитокин – ингибирует цитотоксическую активность Т-лимфоцитов, макрофагов‚ участвует в переключении синтеза IgG1 на синтез IgG4 и IgE. Совместно с другими цитокинами ИЛ-4 способствует пролиферации тканевых базофилов. Антагонистом ИЛ-4 является гамма-интерферон – важнейший фактор, активирующий макрофаги; он способствует более эффективному уничтожению макрофагами внутриклеточных микроорганизмов, запуская поврежденные ранее микробицидные механизмы макрофагов и вызывая гибель внутриклеточных микроорганизмов.

Маркером течения ГВЗ считается изменение уровня иммуноглобулина Е [Перетня Н. Н.‚ Сенькова Л. В.‚ Добродеев К. Г. Капутин С. Л. и др. К вопросу о роли IgE// Объединённый иммунологический форум: Тезисы. – Екатеринбург.- 2004.-С. 119]. В частности клинически неблагоприятным показателем является повышение уровня IgE при ГВЗ . В связи с этим‚ интересным представляется исследование корреляционных взаимосвязей уровней интерлейкина 4 и гамма-интерферона с показателями общего иммуноглобулина Е в сыворотке крови больных с ГВЗ.

3.1. Результаты исследования уровня интерлейкина-4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных с различным уровнем иммуноглобулина Е при хроническом рецидивирующем фурункулезе

Бактериальные инфекции кожи являются важной клинической проблемой ввиду их распространенности во всем мире и недостаточной эффективности терапии этих заболеваний.Наиболее часто встречающиеся инфекционные заболевания кожи включают фолликулиты, фурункулы и карбункулы.Факторами предрасположенности к возникновению рецидивирующего фурункулеза (РФ) являются инфицированные раны, нарушение правил гигиены, диабет, алкоголизм, окклюзивная косметика, тесная одежда, общее ослабление организма, потертости, перегрев, контакт с химическими агентами, неадекватное лечение кожных повреждений, использование стероидных гормонов. Причины развития ХРФ не всегда понятны. Как правило при изучении особенностей рецидивирующего фурункулеза, отмечается наличие аллергического компонента в воспалении при фурункулезе у лиц старшего возраста, что сопровождается повышением общего IgE. Кроме того‚ при ХРФ, как при всякой рецидивирующей инфекции, можно предположить наличие нарушений иммунологической реактивности.

В нашей работе обследовано 34 пациента с ХРФ. Эти пациенты были сформированы в 2 группы‚ в зависимости от уровня IgE: первую группу составили 14 больных с повышенным уровнем IgE, вторую – 20 пациентов с нормальными значениями указанного иммуноглобулина. За дискриминационный уровень принимались показатели иммуноглобулина Е – 130-150 МЕ/мл. Контрольную группу составили 10 человек – доноры без ГВЗ.

3.1.1. Результаты исследования уровня интерлейкина-4 в сыворотке крови у больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом

Результаты исследования уровня интерлейкина-4 в сыворотке крови у больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом приведены на рис. 8 и табл. 1 (Приложение 1).

Согласно полученным результатам достоверное повышение уровня ИЛ-4‚ по сравнению с контрольной группой‚ отмечалось как у больных с повышенными‚ так и нормальными значениями общего иммуноглобулина Е.

Концентрация ИЛ-4 у больных с высокими значениями общего иммуноглобулина Е (выше 150 МЕ/мл) превышала показатели контрольной группы в 10 раз (р< 0,05). Концентрация ИЛ-4 у больных с нормальными значениями сывороточного иммуноглобулина Е (130 МЕ/мл) превышала показатели контрольной группы в 7 раз (р< 0,01). Полученные результаты свидетельствуют о вовлечении ИЛ-4 в формирование иммунного ответа при развитии ХРФ. Однако‚ эти изменения не зависели от показателей общего иммуноглобулина Е в обследуемой группе больных с ХРФ.