Исследование экстрактов биогумуса проводили методом гель-фильтрации на геле сефадекс G-75 с непрерывной автоматической регистрацией оптической плотности элюата в проточной кварцевой кювете, колонка TSK G4000SW (8x300 мм). Объем аликвоты раствора 100 мкл, скорость элюирования 0,4 мл/мин. В качестве элюента использовали 50 мМ фосфатный буфер с рН 7,6. Детектирование пиков хроматограмм осуществляли при 254 нм.
Определение жирнокислотного состава компостов и вермикомпостов проводилось методом газожидкостной хроматографии на хроматографе "Agilent 6890N", оснащенном масс-спектрометрическим детектором "Agilent 5973N" и капиллярной колонкой HP – 5MS 0,25mm×30m×0,25mm. Идентификацию жирных кислот проводили с помощью компьютерного поиска (РВМ) и библиотеки масс-спектров Wiley.
Спектроскопические измерения проводили на спектрофотометре Specord UV/VIS (Carl Zeiss, Jena, Германия). Specord сканирующий UV/VIS спектрофотометр, работающий как автономное устройство со встроенным микропроцессором и в системе с внешним компьютером. Диапазон длин волн 190 - 1100 нм, соответствует требованиям стандарта DAB.
Для спектрофотометрического анализа использовали фотометр фотоэлектрический КФК-3-01.
Спектры ЯМР регистрировались на твердофазном ЯМР-спектрометре Bruker DSX 200 при резонансной частоте 50,3 МГц, с использованием cross-поляризации, magic angle spinning техники c spinning speed 6,8 кГц. Контактное время 1 мсек, pulse delay 400 мсек.
Микроколориметрические исследования гумусовых кислот проводили на адиабатном сканирующем микроколориметре ДАСМ-4А (институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино Московской области, Россия) с объемом рабочей ячейки 0,4672 см3. В каждом эксперименте шкалу теплоемкости калибровали по эффекту Джоуля-Ленца. Диапазон сканирования температур от 20 до 120ºС, скорость нагрева - 2ºС/мин. Концентрация ГВ в растворах составляла 8 мг/мл в 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 0,4 М хлорид натрия с рН 7,7, гуминовых кислот – 6 мг/мл.
Извлечение биологически активных веществ из биогумуса и компоста (контроль) проводили методом экстракции. Выход активного вещества составлял 3,25 мг на 1 кг биогумуса. Приготовленный препарат гуминового комплекса считали как раствор 1:1. Далее готовили испытуемые растворы разведением дистиллированной водой до концентраций 1,5·10-2, 1,5·10-3, 1,5·10-4%.
Для определения каталазы в растениях была использована методика А.И. Ермакова с модификациями (1987).
При определении пероксидазной активности растений использовали колориметрический метод Бояркина А.Н. с модификациями (1981). Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования синего продукта окисления определенной концентрации, заранее устанавливаемой на фотоэлектроколориметре. Измерение проводили с использованием красного светофильтра при длине волны λ =590 нм.
Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) применялась модифицированная методика с использованием фотореактора (GiannopolitiesC.N., Ries S.K., 1977; Гринблат А.И., 2007).
Для лабораторных исследований биологической активности гуминового комплекса использовали сорта гороха, обладающие ценными хозяйственными признаками, но разной степенью восприимчивости к болезням и вредителям: горох "Норд" на зерно (ГНУ ВНИИЗБК, 1992), горох "Орпела" (ГНУ ВНИИЗБК, 1994).
Для полевых исследований влияния растворов гуминового комплекса на поражаемость болезнями и вредителями, продуктивность и урожайность использовался следующие сорта сельскохозяйственных растений: горох "Вега" - овощной сорт (ГНУ ВНИИ селекции овощных культур, 1982), горох "Батрак" (ГНУ ВНИИЗБК, 2000), картофель "Жуковский ранний" (селекция ВНИИ КХ), пшеницу сорт "Крестьянка".
Обработку семян (клубней) проводили путем замачивания в течение 2 часов в растворах гуминового комплекса с концентрациями 1,5·10-2, 1,5·10-3, 1,5·10-4%, вытяжке из компоста с концентрацией 1,5·10-2% и растворе "Гумистар", приготовленного промышленным способом (производство ОАО МНПК "ПИКЪ"), с концентрацией 1,5·10-2%. В качестве контроля использовали замачивание семян в растворе дистиллированной воды.
Для лабораторных опытов семена перед использованием обеззараживали 1 % - ным раствором дезолона. Исследовали 7 вариантов. В 3-х вариантах использовали предпосевную обработку семян (клубней) испытуемыми растворами, и в 3-х сочетали обработку семян с 2-х разовым опрыскиванием растений. Площадь делянки составляла 10 м2 (для гороха и пшеницы), 2 м2 (для картофеля) повторность 4 - кратная. Учёт распространения и развития болезней проводили по методикам Н.Н. Кирика и В.В. Котовой (1979), В.И. Попова, М.Ю. Степановой (1981). Поражённость корневой системы гнилями определяли по 4-х бальной шкале, поражение пятнистостями по 5-ти бальной в фазу бутонизации и цветения (период массового заселения растений вредителями) и в фазу плодообразования (во время массовой откладки яиц) (Котова В.В., 1986).
Опытный материал выращивали в условиях полевого опыта на делянках площадью 10 м2 в 4-х кратной повторности при норме высева 1,2 млн. шт./га размещение делянок риндомизированное. Посадку картофеля производили по схеме: 0,3х0,7 м, густота стояния растений составляла 47619 шт. растений/га.
Обработку семян исследуемыми растворами проводили за 1-2 дня до посева гороха суспензионным способом, вручную. Обработку посевов проводили дважды в период бутонизации и цветения. Анализ семян, обработанных препаратами на всхожесть, заражённость проводили на 4-й, 7-й день после обработки согласно методикам (Методические указания по государственному испытанию фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур, 1985). По сноповому материалу определяли структуру урожая (количество бобов и семян на одном растении и масса 1000 семян) (Методика Госсортсети, 1981).
Обработку экспериментальных данных проводили методом Б.А. Доспехова с помощью компьютерной программы Ехеl (1985).
3. Исследование состава водных и спиртовых экстрактов вермикомпостов
Для сравнительного исследования физико-химических свойств и ферментативной активности экстрактов вермикомпостов был получен биогумус различного периода созревания.
Анализ биогумуса показал, что его химические свойства зависят от времени культивирования (табл. 1).
Вермикомпостирование приводит к повышению рН-среды, рН приближается к нейтральной; общий азот увеличивается.
Содержание обменного калия К2О незначительно снижается, а содержание Р2О5 увеличивается по мере биокомпостирования и находится в пределах величин мирового стандарта. Содержание золы, напротив, значительно возрастает (на 10 - 15%), что обогащает почву необходимыми макро- и микроэлементами. Ключевым показателем при оценке скорости биоконверсии органических отходов и степени зрелости вермикомпостов, по данным международного стандарта, является соотношение С/N. По нашим данным, этот показатель снижается при биокомпостировании, что указывает на его зрелость.
Таблица 1 Агрохимический состав биогумуса различного периода созревания
| Вид удобрения | Гумус, % | рН | Азот общий, % | Зола,% | Р2О5, % | К2О, % | С/N |
| Компост | 17,3 | 5,8 | 2,81 | 57,1 | 1,20 | 0,70 | 22,1 |
| Биогумус (зимний) | 17,8 | 6,3 | 1,71 | 73,2 | 0,78 | 0,71 | 13,7 |
| Биогумус (летний) | 26,2 | 6,3 | 2,25 | 65,6 | 1,13 | 0,66 | 17,7 |
| Международный стандарт | 20-30 | 6,5-7,5 | 1,0 | 57,7 | 1,5 | 1,0 | - |
Анализ микробиологических свойств вермикомпоста показал, что это – продукт с достаточно стабильным микробным сообществом. При естественной влажности (около 74%) он характеризуется определенной пропорцией микробной биомассы: 63-71% - грибной мицелий; 21-28% - споры грибов и дрожжеподобные организмы; 5,6-6,7% - бактерии; 2,3-3,2% - мицелий актиномицетов. В отличие от исходного субстрата в вермикомпосте снижается доля грибного мицелия, но возрастает доля функционально-активного мицелия актиномицетов; в группе бактерий доминируют представители актиномицетной линии; среди грибов преобладают активные целлюлозоразрушающие виды, которые не токсичны и не патогенны для растений, а напротив, обладают антагонистическим эффектом по отношению к фитопатогенным микроорганизмам.
Исследование почвенной микрофлоры образцов биогумуса показало (табл. 2), что аммонифицирующая активность значительно повышается по сравнению с компостом в 2,6 и 1,8 раз соответственно, а нитрифицирующая активность снижается (от 19,2 мг в компосте до 17,8 и 17,6 – в биогумусе).
Таблица 2 Аммонифицирующая и нитрифицирующая активность биогумуса
| Образец | Аммонифицирующая активность N-NH4+ мг/100г образца (при компостировании с люпиновой мукой) | Нитрифицирующая активность N-NО3- мг/100г образца (при компостировании с сульфатом аммония) |
| Компост | 5,6 | 19,2 |
| Биогумус, зимний | 14,5 | 17,8 |
| Биогумус, летний | 10,0 | 17,6 |
Установлено, что все образцы обладают высокой целлюлозоразрушающей активностью, что положительно сказывается на закреплении азота в органической биомассе целлюлозорарушающих микроорганизмов.