Клетки сохраняют, как правило, все системы жизнеобеспечения. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы.
Для многих типов клеток, особенно микробных, разработаны эффективные методы генетических операций, дающие возможность получать мутанты с высоким содержанием того или иного белка или фермента, что дает возможность оперировать с высокоэффективными каталитическими системами. Поскольку клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка, потенциально могут быть разработаны высокоэффективные методы генодиагностики. Основными недостатками этих биосенсоров являются медленный отклик электрода, связанный с необходимостью использовать толстые мембраны, а также сравнительно низкая селективность, обусловленная присутствием в клетке или тканях нескольких ферментных систем.
Для создания клеточных биосенсоров используют различные физические трансдьюсеры: электрохимические (амперометриче-ские, потенциометрические), оптические, акустические, калориметрические. Развитие получили биосенсоры с использованием техники LAPS (светоадресуемых потенциометрических сенсоров). На основе LAPS-системы созданы достаточно чувствительные системы слежения за физиологическим состоянием отдельных клеток - так называемые микрофизиометры.
Для создания биосенсоров используют микроорганизмы: Neyrospora europea - для определения аммиака, Trichosporon brassicae - для определения уксусной кислоты, Sarcina flava — для определения глутамина, Azoiobacier vineiaudii — для определения нитратов и другие. В тканевых электродах используют срезы почек и печени свиньи, срезы желтой тыквы, банана и другие. На основе гриба Aspergilus niger группой японских ученых были созданы биосенсоры для определения биогенных аминов в мясных продуктах.
Для иммобилизации клеток с сохранением их активности первоначально использовали материалы природного происхождения: желатину, агар, альгинат кальция, каррагенан. В последние годы разработаны и развиты методы включения живых клеток в синтетические полимерные гели. Особенно интересные и перспективные результаты получены с использованием так называемого метода криоиммобилизации клеток. Процедура крио-иммобилизации состоит из стадии получения суспензии клеток: в растворе полимера, замораживания суспензии с получением криоструктурированных гелей, размораживания с образованием пористого, механически прочного материала, устойчивого до температур 70-80°С. Клетки, включенные в такого рода пористый материал, сохраняют активность и способны функционировать в течение нескольких месяцев.
64. Приведите примеры микробных ферментов, использующихся вместо растительных и животных.
Микробные ферменты все активнее заменяют растительные и животные ферменты. Так, амилазы из Bacillus и Aspergillus заменили аналогичные ферменты из пшеничного солода и ячменя в пивоварении, хлебопечении и производстве сухого печенья, а также в текстильной промышленности; протеазы из Aspergillus - животные и растительные протеазы, употребляемые для размягчения мяса: протеазы из Aspergillus и Bacillus lichemformis заменили панкреатические протеазы в процессе размягчения кожи (дубления) и в производстве моющих средств; реннины из Mucor — сычужный фермент из желудка телят в сыроварении.
Ферменты и их применение
| Ферменты | Продуценты | Применение |
| Амилазы | Бактерии, грибы | Производство патоки, глюкозы, этанола. Добавка к хлебопродуктам. Способствующее пищеварению средство |
| Протеазы из микроорганизмов | Бактерии, грибы | Производство и созревание сыра. Приготовление соевого соуса и получение аминокислот. Выделка кожи. Активаторы пищеварения (дайджестанты). Осветление пива. Удаление белковых комков из алкогольных напитков. Размягчение мяса (папайи). Производство моющих средств. |
| Реннин | Желудок теленка, грибы | Производство сыра |
| Липазы | Дрожжи | Производство масла и глицеридов. Активаторы пищеварения (дайджестанты) |
| Пеюгйназы | Грибы | Осветление и повышение выхода зина и фруктовых соков |
| Гемицеллюлазы | Грибы | Гидролиз гемицеллюлоз злаков и овощей |
| Целлголазы | Грибы | Гидролиз целлюлозы в глюкозу. |
| Инулаза | Бактерии, грмбы | Гидролиз инулина во фруктозу. |
| Инвертаза | Дрожжи | Предотвращение кристаллизации сахара в производстве кондитерских изделий. Производство шоколада, высококачественной мелассы. |
| Глюкозоизомераза | Бактерии | Превращение глюкозы во фруктозу, |
| Нарингиназа | Грибы | Устранение горького привкуса соков цитрусовых. |
| Антоцианаза | Грибы | Обесцвечивание фруктовых соков |
| ДНКаза, рибонуклеотидаза | Бактерии, грибы | Гидролиз ДНК; получение монодезоксирибо- нуклеотидов и рибонуклеотидов, получение инозиновой кислоты |
| Глюкозооксидаза | Бактерии | Удаление кислорода или деструкция глюкозы для антисептики пищевых продуктов. Получение обезвоженного яичного порошка. |
| Каталаза | Бактерии | Стерилизация молока |
| Уреаза | Дрожжи, грибы | Разрушение мочевой кислоты |
В настоящее время в промышленных масштабах получают четыре фермента: протеазу, глюкоамилазу, а-амилазу и глюко-зоизомеразу. Мировой рынок данных ферментов оценивается на сумму около 300 млн долл. Ежегодно производится 530 т протеа-зы, 350 т глюкоамилазы, 320 т а-амилазы и 70 т глюкозоизоме-разы. Основными производителями являются европейские компании, причем 60% всей мировой торговли ферментами приходится на датскую фирму «Ново индастри» и голландскую фирму «Гито-Брокадес НВ».
Все ферменты подразделяют на две категории - внеклеточные и внутриклеточные ферменты. К первой категории относятся ферменты, выделяемые клеткой в среду, где они расщепляют питательные полимерные вещества до низкомолекулярных соединений, которые могут проникать в клетку через клеточную стенку. Внутриклеточные ферменты в нормальных условиях сконцентрированы в объеме клетки и в среду не транспортируются. Поэтому для их выделения необходимо разрушить клетки тем или иным способом.
Для некоторых областей применения ферментов необходимы относительно чистые препараты. Например, глюкозооксидаза, применяющаяся в производстве яичного порошка, не должна содержать ферменты расщепления яичного белка. Протеазы, водимые внутримышечно домашнему скоту перед забоем для мягчения мяса не должны содержать никаких соединений, которые могли бы вызвать аллергическую реакцию у потребителей этого мяса. Относительно чистые ферменты применяются в клинической диагностике и в процессах, связанных с производством и обработкой пищевых продуктов.
В то же время многие из применяемых в промышленности препаратов ферментов очищены в гораздо меньшей степени. Как правило, они содержат ряд ферментов с различными каталитическими свойствами.
Ценность, полученных микробиологическим способом ферментов наиболее ярко демонстрирует превращение крахмала в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы, заменяющую сахарозу в безалкогольных напитках. Хотя этот процесс внедрен в производство недавно, он уже дает более 2 млн. т патоки в год. Превращение крахмала происходит в три этапа, на которых субстрат последовательно подвергается воздействию а-амилазы, глюкоамилазы и глюкозоизомеразы.
Стоимость выработанной патоки зависит исключительно от эффективности способа получения ферментов. Буньи Маруо и его сотрудники из Университета Нихон увеличили выход а-амилазы из Bacillus subtilis почти в 200 раз, комбинируя классические методы мутагенеза и селекции с техникой генетической рекомбинации. Они обнаружили ряд регуляторных механизмов, контролирующих синтез а-амилазы; действуя совместно, эти регуляторы повышают выход фермента в отобранных штаммах В.subtilis.
Технология рекомбинантных ДНК была использована также для производства температуроустойчивой а-амилазы. Бактерия B.subtilis растет при комнатной температуре, и синтезируемая ею а-амилаза легко денатурируется при нагревании. Если бы фермент обладал активностью при повышенной температуре, каталитическое расщепление крахмала до глюкозы протекало бы с более высокой скоростью. Один из возможных путей для получения такого фермента - это встраивание в геном B.subtilis гена а-амилазы из термофильной бактерии. Термофильные бактерии живут при повышенной температуре, и их ферменты устойчивы к нагреванию. Однако эти бактерии не могут служить источником а-амилазы, так как организация их генома изучена плохо. Шойи Шиномия и его сотрудники из Токийского университета продемонстрировали, что введение в В.subtilis гена а-амилазы из термофильной бактерии приводит к увеличению выхода термостабильной а-амилазы.
Другим путем повышения эффективности производства фруктозы могла бы стать замена трех этапов утилизации крахмала одним. Этого можно достичь, включив в геном одного организма гены для а-амилазы, глюкоамилазы и глюкозоизомеразы Превращение крахмала в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы проходило бы тогда в одном ферментационном сосуде.
Протеазы в промышленных масштабах выделяют из организмов животных (из поджелудочной железы), высших растений (из соков и латексов), а также из дрожжей, плесеней и бактерий.
Протеазы применяются в производстве моющих средств, в химической чистке, при мягчении мяса, в сыроделии (только реннин), дублении, извлечении серебра из фотографических пленок и бумаг, производстве препаратов, способствующих пищеварению, а также в медицине при лечении воспалительных процессов и ран.