6. Определение белка в сыворотке крови
Содержание белка в сыворотке крови рыб служит экспресс - тестом для определения уровня физиологического состояния рыб при выращивании в современных рыбоводных хозяйствах. Концентрацию белка выражают в г % или в г/л; 1 г/л равен 10 г %.
6.1. Оборудование и реактивы:
- уленгутки или небольшие пробирки,
- штатив,
- центрифуга,
- рефрактометр,
- пастеровские пипетки,
- спирт.
6.2. Ход определения и учет результатов
2-3 мл крови, полученной одним из методов (см. п.2.), помещают в подготовленные уленгутки или небольшие пробирки. После этого кровь центрифугируют 5 минут при 3000 об./мин. В случае отсутствия центрифуги проводят отстаивание крови в холодильнике 30 - 45 минут. Полученная после центрифугирования или отстаивания сыворотка отсасывается чистой пастеровской пипеткой и несколько се капель помещают на пластинку рефрактометра. Регистрируют показатель преломления по его шкале. По таблице 1, приведенной ниже, определяют содержаниебелка в сыворотке крови. После каждого исследования обе поверхности призм протирают марлевым тампоном, смоченным в спирте.
7. Определение числа эритроцитов пробирочным методом в камере Горяева
Число эритроцитов (в млн. в 1 мкл) - важный показатель физиологического состояния рыб, который характеризует наличие анемии.
7.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление раствора Хендрикса:
- сульфат натрия - 20 г, хлористый натрий - 5 г, цитрат натрия трехзамещенный - 3 г, ледяная уксусная кислота - 100 мл, вода дистиллированная до 1 ()()() мл.
7.2. Оборудование и реактивы;
- химические пробирки с пробками,
- градуированная пипетка на 5 мл,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- пастеровская пипетка,
- камера Горяева,
- микроскоп,
- раствор Хендрикса.
7.3. Ход определения и учет результатов
Градуированной пипеткой в химическую пробирку наливают 4 мл раствора Хендрикса. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают в пробирку, осторожно промывая капилляр несколько раз. Покровное стекло притирают к камере Горяева до появления ньютоновских колец. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и пастеровской пипеткой заполняют камеру Горяева. Через 1-2 минуты начинают подсчет числа эритроцитов под микроскопом в 5 больших или 80 малых квадратах, расположенных по диагонали. Для определения количества эритроцитов в 1 мкл достаточно умножить полученное при подсчете число эритроцитов на 10000.
Таблица 1
Концентрация белка (в г %) при различном показателе преломления*
| Концентрация белка (в г %) | ||||||||||
| Показа- тель преломления | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 1,337 | 0,60 | 0,66 | 0,72 | 0,77 | 0,83 | 0,89 | 0,95 | 1,01 | 1,07 | 1.12 |
| 1,338 | 1,18 | 1,24 | 1,30 | 1,36 | 1,41 | 1,47 | 1,53 | 1,59 | 1,65 | 1,70 |
| 1,339 | 1,76 | 1,82 | 1,88 | 1,94 | 2,00 | 2,05 | 2,11 | 2,17 | 2,23 | 2,29 |
| 1,340 | 2,34 | 2,40 | 2,46 | 2,52 | 2,58 | 2,63 | 2,69 | 2,75 | 2,81 | 2,87 |
| 1,341 | 2,93 | 2,98 | 3,04 | 3,10 | 3,16 | 3,22 | 3,27 | 3,33 | 3,39 | 3.46 |
| 1,342 | 3,51 | 3,57 | 3,62 | 3,68 | 3,74 | 3,80 | 3,86 | 3,91 | 3,97 | 4,03 |
| 1,343 | 4,09 | 4,15 | 4,20 | 4,26 | 4,32 | 4,38 | 4,44 | 4,50 | 4,55 | 4,61 |
| 1,344 | 4,67 | 4,73 | 4,79 | 4,84 | 4,90 | 4,96 | 5,02 | 5,08 | 5,13 | 5,19 |
| 1,345 | 5,25 | 5,31 | 5,37 | 5,43 | 5,48 | 5,54 | 5,60 | 5,66 | 5,72 | 5,77 |
| 1,346 | 5,83 | 5,89 | 5,95 | 6,01 | 6,07 | 6,12 | 6,18 | 6,24 | 6,30 | 6,36 |
| 1,347 | 6,41 | 6,47 | 6,53 | 6,59 | 6,65 | 6,70 | 6,76 | 6,82 | 6,88 | 6,94 |
| 1,348 | 7,00 | 7,05 | 7,1) | 7,17 | 7,23 | 7,29 | 7,34 | 7,40 | 7,46 | 7,52 |
| 1.349 | 7.58 | 7,63 | 7,69 | 7,75 | 7,81 | 7,87 | 7.93 | 7,98 | 8,04 | 8,10 |
| 1,350 | 8,16 | 8,22 | 8,27 | 8,33 | 8,39 | 8,46 | 8,51 | 8,57 | 8,62 | 8,68 |
| 1,351 | 8.74 | 8,80 | 8,86 | 8,91 | 8.97 | 9,03 | 9,09 | 9,15 | 9,20 | 9,26 |
| 1,352 | 9,32 | 9,38 | 9,44 | 9,50 | 9,55 | 9,61 | 9,67 | 9,73 | 9,79 | 9,84 |
| 1,353 | 9,90 | 9,96 | 10,02 | 10,08 | 10,13 | 10,19 | 10,25 | 10,31 | 10,37 | 10,4 |
*при наличии гемолиза необходимо из результатов определения общего содержания белка вычесть эксперименталыю установленную поправку на степень гемолиза: при " l " - 0,6 -0,7; при "++" 1,2 - 1,4; сильногемолиэированная сыворотка для определения общего содержания белка использована быть не может.
8. Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ)
Показатель среднего содержания гемоглобина в одном эритроците очень важен для выявления гипо- и гиперхромачии. СГЭ в одном эритроците принято выражать в пикограммах (синоним - микромикрограмм); 1 пг- КГ12 г.
8.1. Ход определения и учет результатов.
СГЭ в одном эритроците определяют делением концентрации гемоглобина в 1 мкл крови, выраженной в грамм-процентах, на число эритроцитов в этом же объеме. Для упрощения расчетов можно разделить содержание гемоглобина, выраженное в г/л, на число эритроцитов в миллионах.
9. Определение среднего объема эритроцитов
Для выяснения наличия микро- и макроцитозов наряду с непосредственным измерением размеров эритроцитов на мазках удобнее вычислять средний объем эритроцитов косвенно, который выражают в кубических микрометрах (мкм3).
9.1. Ход определения и учет результатов.
Для определения среднего объема эритроцитов показания гематокритного числа делят на число эритроцитов в 1 мкл крови.
Практически средний объем эритроцитов определяют по формуле:
А х 1000/Б,
где: А - гематокритное число, л/л ; Б - число эритроцитов , млн /мкл .
10. Определение скорости оседания эритроцитов
В зависимости от физических и химических свойств крови эритроциты оседают в микрокапиллярах с различной скоростью. Скорость оседания эритроцитов определяется в аппаратах Панченкова и выражается в миллиметрах за 1 ч (мм/ч).
10.1. Оборудование и реактивы:
- часовое стекло,- аппарат Панченкова, состоящий из штатива и специальных капиллярных пипеток, на которых нанесена миллиметровая шкала длиной К) см; верхнее деление шкалы отмечено буквами О и К (кровь), против деления 50 имеется буква Р (реактив),
- профильтрованный 5-% раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия.
10.2. Ход определения и учет результатов.
Промывают капиллярную пипетку раствором лимоннокислого натрия, затем набирают этот раствор до метки Р и выливают его в часовое стекло. Тем же капилляром набирают кровь 2 раза до метки К и спускают в часовое стекло. Хорошо перемешивают и, набрав смесь в капилляр до метки К, ставят в штатив на ! ч. По истечении этого времени определяют скорость оседания эритроцитов. Величину столбика плазмы, освободившегося от эритроцитов, учитывают по делениям на капиллярной пипетке.
При работе с молодью рыб допускается набирать меньший объем крови (1/2 или 1/4 К), при этом соотношение лимоннокислого натрия и крови необходимо строго сохранять на уровне 1:2.
11. Оценка эритроцитарной картины крови рыб
По соотношению молодых и зрелых форм эритроцитов оценивают активность эритропоэза. Соотношение эритроцитов выражают в процентах (%).
11.1. Оборудование:
- микроскоп,
- окрашенные мачки крови (см. п. 3.),
- иммерсионное масло.
11.2. Ход определения и учет результатов. Под микроскопом на мазке крови просматривают нс менее 1000 эритроцитов при увеличении х 630 (под иммерсией). Клетки идентифицируют, используя "Атлас клеток крови рыб" (Иванова, 1983) и выводят процент различных стадий созревания эритроцитов по формуле:
Х =• (А х 100)/1000= А х-0,1%,
где: А - число незрелых эритроцитов, встречающихся при подсчете 1000 эритроцитов;
Х - искомый процент незрелых эритроцитов.
12. Определение общего числа лейкоцитов
Лейкоциты, как клетки белой крови рыб, выполняют разнообразные физиологические и иммунологические функции. Они участвуют в регенерации поврежденных тканей, разрушении чужеродных тел, синтезе белка и антител, инкапсуляции паразитов и т.д. Существует непрямой (косвенный) и прямой способ учета лейкоцитов в периферической крови рыб. Число лейкоцитов выражают в 1 мкл крови (тыс. шт. / мкл).
12.1. Косвенный метод
12.1.1.Оборудование:
- микроскоп,
- окрашенные мазки крови (см. п. 3),
- иммерсионное масло.
12.1.2. Ход определения и учет результатов. Определяют число лейкоцитов, встречающихся при подсчете 1000 эритроцитов в мазке крови, и затем пересчитывают их количество на 1 мкл по формуле:
Х = (А х В)/1000,
где: Х - общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови;
А - число эритроцитов в 1 мкл крови, определенное в камере Го-ряева:
В - число лейкоцитов, определенное при подсчете 1000 эритроцитов на мачке крови.
12.2. Прямой метод подсчета количества лейкоцитов 12.2.1
12.2.1. Подготовка к исследованию.
Приготовления растворов А и В
- 25 мг нейтральрота и 0,6 г натрия хлористого растворяют в 100 мл дистиллированной воды ( раствор А можно использовать одни сутки);
- 12 мг кристаллвиолета, 3,8 мг натрия цитрата и 0,4 мл формалина растворяют в 100 мл дистиллированной воды (раствор В использовать около недели).
12.2.2. Оборудование и реактивы:
- микроскоп,
- счетная камера форменных элементов крови,
- смеситель для подсчета эритроцитов млекопитающих,
- пастеровские пипетки - стерильные,
- часовое стекло,
-2 -% раствор натрия цитрата,
- растворы А и В.
12.2.3. Ход определения и учет результатов.
Взятие крови производят в соответствии с п.2 настоящих Методических указаний. Кровь из часового стекла набирают в смеситель для подсчета эритроцитов млекопитающих до метки 0,5 или 1. Кончик смесителя вытирают ватой, набирают в смеситель раствор А до половины расширения смесителя, затем до метки 101 заполняют раствором Б.