Если кровь набирают до метки 0,5, то получается разбавление в 200 раз, если до метки 1 - в 100 раз.
После наполнения со смесителя снимают резиновую трубку, зажимают его между большим и средним пальцем и перемешивают кровь с разбавляющей жидкостью. Смеситель оставляют в горизонтальном положении на 5-10 минут, затем вновь перемешивают. Первые 2-3 капли, выходящие из смесителя, стряхивают и только следующей каплей заряжают счетную камеру. Покровное стекло должно быть заранее притерто к счетной камере до появления колец Ньютона. Под действием растворов А и В происходит витальная окраска форменных элементов крови. Ядра лейкоцитов окрашиваются в темный фиолетово-красный цвет, а протоплазма - в розовый. В эритроцитах слабо окрашиваются только ядра. Благодаря этому эритроциты и лейкоциты различимы в камере.
Количество лейкоцитов подсчитывают в 80 больших квадратах и определяют их количество по формуле:
x=mx250xУ/п, гдe:
Х - число лейкоцитов в 1 мкл,
М- общее количество клеток в подсчитанных квадратах,
У - степень разбавления крови,
п - число просмотренных квадратов.
13. Выведение лейкоцитарной формулы.
Для характеристики лейкоцитозов и лейкопений, возникающих у рыб при различных заболеваниях, используют дифференциальный подсчет лейкоцитов, то есть выводят лейкоцитарную формулу. Количество различных групп лейкоцитов выражают в процентах (%).
Лейкоцитарный состав представлен у рыб эозинофилами, нейтрофи-лами, базофилами, относящимися к гранулоцитам; лимфоцитами и моноцитами, относящимися к агранулоцитам, а также бластами.
13.1. Оборудование:
- микроскоп,
- окрашенные мазки крови (см. п. 3.),
- иммерсионное масло.
13.2. Ход определения и учет результатов.
Для определения лейкоцитарной формулы производят подсчет 200 клеток белой крови в мазке под увеличением микроскопа об.90 х ок.7 (с иммерсией). Подсчет лейкоцитов лучше проводить в центральных и несколько удаленных от бокового края участках начальной трети части мазка. Все встречающиеся клетки белой крови записывают в специальную таблицу в соответствии с классификацией клеточных форм (Иванова, 1983) и рассчитывают процентное соотношение клеток белой крови, то есть групп лейкоцитов в процентах. Для этого используют формулу:
Х = (А х 100) / 200, где:
Х - процент определяемой группы клеток в лейкоцитарной формуле; А - количество этих клеток, найденное при подсчете 200 лейкоцитов (по показанию счетчика).
Лейкоцитарная формула указывает только на относительное соотношение лейкоцитов. Для определения их абсолютного значения используют формулу пересчета, т.е. выясняют количество каждого вида клеток в 1 мкл крови (шт./мкл).
Формула пересчета:
Х = (А х В) /100, где:
А - процент определяемой группы лейкоцитов в лейкоцитарной формуле, %;
В - общее число лейкоцитов в 1 мкл, тыс. шт./мкл;
100 - общий процент всех лейкоцитов в лейкоцитарной формуле. %.
14. Определение метгемоглобина
При накоплении метгемоглобина в крови выше определенного уровня возникает патологическое состояние, называемое метгемоглобинемией. Вследствие метгемоглобинемии снижается кислородная емкость крови и развивается гипоксия, что сопровождается торможением обменных процессов и накоплением недоокисленных продуктов в тканях.
Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглоби-на (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксиге-моглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия , с использованием фотоэлектроколориметра при красном светофильтре.
14.1. Подготовка к исследованию 0,25% - ный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды.
Насыщенный раствор фсррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды, раствор хранят не более недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистиллированной воды.
14.2. Оборудование и реактивы
Аммиак водный (nh4ОН),ГОСТ 3760-64.
Калий железосинеродистый (феррицианнд калия, соль кровяная красная) ГОСТ 4206-65. Гепарин (25000 ед.).
Химические пробирки.
Пипетки на 1, 10 мл.
Фотоэлектроколориметр (ФЭК) с красным светофильтром.
14.3. Ход определения и учет результатов
Для а налита у исследуемых рыб отбирают в пробирку 1 мл крови из сердца или хвостовой артерии. Кровь стабилизируют, добавляя в пробирку 2-3 капли раствора гепарина. У молоди рыб возможно групповое взятие крови (от 2 рыб и более).
При необходимости перевозки или хранения проб крови, закрытые пробками пробирки с кровью помещают в термос со льдом или в морозильную камеру холодильника с температурой - 12° С, кровь можно хранить в течение нескольких суток.
Перед исследованием кровь размораживают и тщательно перемешивают.
В две химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25 %-го раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой пробы (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка № 2) добавляют 1-2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, перемешивают содержимое пробирок и оставляют обе пробирки на 1 час. Через 1 час определяют величину оптической плотности (экстинцию) обоих растворов крови, в кюветах 10 мм при красном светофильтре, используя для сравнения 0,25 % -ный раствор аммиака.
В первой пробирке (пробирка № 1) определяют величину светопо-глощения раствора крови, с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина), во второй пробирке (пробирка № 2) - величину светопо-глощения раствора крови, в которой весь оксигемоглобин (Нв02) превращен в метгемоглобин (mthb).
Содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.
Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка № 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощеиил раствора метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина, то есть оксигемоглобина.
Определение светопоглощенил растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлекгроколориметре (ФЭКе) при красном светофильтре.
У ФЭКов различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭКа - 56 при работе с красным светофильтром № 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотометров ФЭК-56 ПМ и ФЭК КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 -670 нм,
Определение светопоглощения растворов крови проводят с использованием ФЭКов различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длины волн, используя для сравнения 0,25 %-ный раствор аммиака в кюветах с рабочей длиной 10 мм.
Различия, связанные с измерением экстинций растворов крови при различающихся длинах волн при работе на ФЭКах различных марок, корригируют путем введения в расчетную формулу коэффициента - величины приведенной экстинции раствора крови с исходным уровнем ок-сигемоглобина (ЕнвО2), как показано в разделе - расчет результатов анализа. При расчете этой приведенной величины используют измеренные опытным путем величины светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2)
- пробирка № 1; метгемоглобина (emthb) - пробирка № 2.
Предварительно опытным путем на молоди карповых рыб установлена средняя величина светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2) и средняя величина светопоглощения раствора крови с полученным уровнем метгемогдобина (ЕМthв).
Таким образом, найдено, что среднее значение плотности раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (ЕнвО2) составляет 0,15, а метгемоглобина (emthb) - 0,77.
Поскольку гемоглобин в пробе крови рыб полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,62 (0,77-0,15) соответствует 100 % содержания метгемоглобина.
Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови рыб по данной методике.
По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови рыб с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка № 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка № 2) и рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенной формуле, используя установленный коэффициент и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн,
Х=(e2-e1) x 1,61 x 100, где:
Х - содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %; е2 - приведенное значение светопоглощения"раствора оксигемоглобина (ЕhвО2), расчет его приводится ниже е1 - среднее значение величины светопоглощения раствора оксигемоглобина, равное 0,15; 1,61 - расчетный коэффициенг, найденный из средних величин светопоглощения растворов оксигемоглобина и метгемоглобина, расчет его также приводится далее. Значение Е; - приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина
(ehbo2) находят из пропорции с использованием измеренных величин светопоглощения раствора оксигемоглобина (пробирка №1) и метге-моглобина (пробирка № 2) в опыте. e2 e4 e3xe4 -— = — откуда Е2=———— , где:
e3 e5 e5
Е2 - искомая величина - приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина - (ЕНвО2); Е3 - среднее (для рыб) значение оптической плотности раствора мет-гемоглобина, равное 0,77; Е4 - измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (пробирка № 1); e5 - измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина (пробирка № 2).Полученное значение Е2 подставляют в формулу для расчета содержания метгемоглобина в крови рыб.
Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (Е2) будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора оксигемоглобина (е1 = 0,15) (что объясняется индивидуальными колебаниями содержания гемоглобина в крови рыб), то содержание метгемоглобина будет равно или меньше 1,61 %.