Аналогичным способом готовят последующие разведения: до 1:1000 для сухих и до 1:10000 для жидких яичных продуктов.
При приготовлении разведений соблюдают условия, исключающие вторичное микробное загрязнение. Полученные разведения используют для посевов. Время с момента окончания приготовления последнего разведения до начала высева не должно превышать 20 мин.
Подготовка, мойка и стерилизация лабораторной посуды, инструментов и материалов
Лабораторную посуду моют в отдельном помещении, применяя щетки, ерши в сочетании с моющими растворами полужидкого мыла, мыльного раствора, стиральных порошков, разрешенных для мойки лабораторной посуды. Закупорившиеся каналы пипеток прочитают тонкой проволокой. Для устранения со стекла налета белого цвета, посуду помешают в 5 – 10 %-ный раствор соляной кислоты на 30 – 40 мин. После мытья посуду прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной.
Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре (103±2)°С. Флаконы, пробирки, колбы, бутыли закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки и обвязывают шпагатом. Чашки Петри по 3 – 6 шт. заворачивают в плотную оберточную бумагу, пергамент, подпергаме1ГТ. В верхнюю часть градуированных и пастеровских пипеток вставляют кусочек ваты. Затем их заворачивают в бумагу; и последнюю надписывают, указывая объем завернутых пипеток.
Лабораторную посуду стерилизуют сухим жаром при температуре (160±3)°С в течение (150±5) мин или в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 20 – 30 мин.
Приготовление питательных сред, красок и реактивов
Мясная вода
Охлажденную говядину или конину освобождают от костей, сухожилий, жира, пропускают через мясорубку. 1 кг полученного фарша заливают двух- или четырехкратным количеством водопроводной воды (по массе), нагревают и кипятят в течение полутора часов, постоянно помешивая и удаляя накипь. После кипячения мясную воду остужают, удаляют жир. Жидкость фильтруют через вату или полотно, потом через фильтровальную бумагу до полной прозрачности. Фильтрат измеряют и доливают до первоначального объема кипяченой водопроводной водой, затем разливают по бутылям и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 30 мин.
Мясо-пептонный бульон
К 1 дм3 мясной воды добавляют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия и 100 см3 дистиллированной воды (на выкипание): кипятят до растворения пептона. В горячий бульон добавляют 10 %-ный раствор гидрата окиси натрия и устанавливают рН (7,4 ± 0,2), после чего бульон кипятят ещё раз в течение 15 мин и фильтруют через увлажненный дистиллированной водой складчатый бумажный фильтр. Профильтрованный бульон должен быть совершенно прозрачным, соломенно-желтого цвета. Бульон разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.
Мясо-пептонный агар
К приготовленному мясо-пептонному бульону добавляют агар-агар: 2 г для приготовления полужидкого или 20 г – для приготовления плотного мясо-пептонного агара. Смесь кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до латного растворения агара.
Приготовленный мясо-пептонный агар разливают в пробирки или в колбы и стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ± 1)°С в течение 20 мин.
Пептонная вода
К 1 дм3 дистиллированной воды прибавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, устанавливают рН (7,4 ± 0,2), кипятят таким образом, чтобы после кипячения он находился в ранее установленных пределах, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 30 мин.
Изотопический раствор хлористого натрия
8,5 г хлористого (хлорида) натрия растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.
Среда Кесслер (с лактозой)
10 г пептона, 50 см3 натуральной стерильной или 5 г сухой говяжьей желчи добавляют к 1 дм3 водопроводной воды, тщательно перемешивают, кипятят в течение 20 – 30 мин, фильтруют через ватный фильтр, добавляют 2,5 г лактозы и доводят объем дистиллированной водой до 1 дм3. Устанавливают рН (7,5± 0,1), добавляют 2 см3 1 %-ного водного раствора кристаллического фиолетового или генциан фиолетового. Среду разливают в пробирки с поплавками по 5 см3 и стерилизуют при температуре (112±1)°С 15 мин. Среда имеет фиолетовый цвет.
Среда Хейфеца с лактозой
В колбу вместимостью 1 дм3 вносят 10 г пептона, 5 г лактозы, 5 г хлористого натрия и индикаторы: 1 см3 5 %-ного спиртового раствора розоловой кислоты и 2,5 см3 0,1 %-ного водного раствора метиленового синего (голубого), заливают 1 дм3 водопроводной воды и нагревают до кипения. Устанавливают рН 7,4 – 7,6. Среду разливают по 10 см3 в стерильные пробирки с поплавками. Стерилизуют при температуре (112±1)°С в течение 20 мин.
Приготовление индикаторов
0,5 г порошка розоловой кислоты всыпают во флакон с притертой пробкой и заливают 10 см3 этилового ректификованного спирта с массовой долей 96%. Через 24 ч раствор готов к употреблению. Раствором можно пользоваться в течение месяца.
0,1 г метиленового синего (голубого) заливают 100 см3 дистиллированной воды, ставят на сутки в термостат при температуре (37±0,5)°С. Срок пользования водного раствора метиленового синего (голубого) не ограничен.
Индикатор Андреде
0,5 г кислого фуксина растворяют в 16,4 см3 1 н. раствора гидрата окиси натрия, прибавляют 100 см3 дистиллированной воды, настаивают 24 ч при температуре (37±1)°С, стерилизуют кипячением в течение 5 мин. Приготовленный таким образом индикатор имеет соломенно-желтый цвет. При смешении рН в кислую сторону индикатор Андреде приобретает ярко-малиновую окраску. Индикатор сохраняют во флаконах темного стекла с притертой пробкой.
Индикатор бромтимоловый синий
0,4 г бромти молевого синего растворяют в 40 см3 дистиллированной воды, нагревая ее до кипения. После этого к раствору прибавляют 6,4 см3 децинормального раствора гидрата окиси натрия, в результате чего жидкость приобретает зеленоватый цвет, и доливают дистиллированной водой до 100 см3. Приготовленный таким образом индикатор может сохраняться в темном месте в склянке с притертой пробкой в течение длительного времени.
Среды Гисса с углеводами
К 1 дм3 дистиллированной воды прибавляют 10 г пептона, 5 г хлористого (хлорида) натрия и нагревают до растворения в течение нескольких минут, затем фильтруют через бумажный фильтр до тех пор, пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают рН (7,2 ± 0,2), прибавляют 10 г одного из необходимых видов углеводов (лактозы, глюкозы, сахарозы, маннита и мальтозы), а затем индикатор Андреде в количестве 10 см3 или 1 см3 1,6 %-ного раствора бромтимолового синего на 1 дм3 среды.
Готовую среду разливают по 5 см3 в пробирки, заранее простерилизованные вместе с пробирками и поплавками, расположенными запаянным конном кверху; стерилизуют при температуре (112±1)°С в течение 20 мин. Во время стерилизации поплавки заполняются доверху питательной средой. Среды Гисса с индикатором Андреде имеют соломенно-желтый цвет, с индикатором бромтимоловым синим – болотно-зеленый.
Среда с углеводом (маннитом иди мальтозой) и феноловым красным
К 1 дм3 стерильного питательного агара добавляют 52 см3 1,6 %-ного водного раствора фенолового красного и 10 г углеводов (маннита или мальтозы). Предварительно углеводы растворяют в небольшом объеме стерильной дистиллированной волы.
Готовят 1,6 %-ный водный раствор фенолового красного, для чего в 100 см3 стерильной дистиллированной воды растворяют 1,6 г индикатора,
К расплавленному и охлажденному до (80±2)°С стерильному питательному агару добавляют углеводы (маннит или мальтозу) и индикатор феноловый красный, смесь перемешивают, при необходимости еще раз расплавляют готовую среду, разливают в стерильные чашки Петри и подсушивают. Среда пурпурно-красного цвета. Среду готовят с соблюдением стерильности.
Среда Ресселя
К 1 дм3 2,0 %-ного питательного или мясо-пептонного агара (рН 7,2) прибавляют 10 г лактозы, 1 г глюкозы и 10 см3 индикатора Андреде. Среду разливают в пробирки в количестве 5 – 6 см3, стерилизуют в автоклаве при (112±1)°С в течение 20 мин и скашивают так, чтобы на 2 – 3 см от дна пробирки агар оставался в виде столбика. Готовая среда бледно-розового цвета.
Среда Кауфмана
Колбу, содержащую 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, наливают в нее 90 см3 мясо-пептониого бульона и стерилизуют при (121±1)°С 30 мин. Перед посевом в асептических условиях в колбу добавляют 2 см3 раствора Люголя, 10 см3 50 %-ного раствора серноватистокислого натрия (тиосульфата), 5 см3 стерильной желчи и 1 см3 водного раствора бриллиантового зеленого в соотношении 1:1000. Смесь тщательно взбалтывают.
Раствор бриллиантового зеленого
1 г бриллиантового зеленого растворяют 100 см3 спирта ректификата с массовой долей 96 % и настаивают в течение 24 ч. К 10 см3 полученного 1 %-ного спиртового раствора доливают до 100 см3 дистиллированной волы, тщательно взбалтывают. Полученный водный раствор бриллиантовой зелени в соотношении 1:1000.
Желчь
Отобранную асептически желчь крупного рогатого скота прогревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После отстаивания фильтруют и разливают по колбам, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 20 мин или однократно в автоклаве при температуре (112±1)°С. Можно использовать сухую желчь, при этом 1 г сухой желчи соответствует 10 м3 натуральной желчи.
Раствор Люголя для приготовления среды Кауфмана
25 г йодида калия растворяют в 5 – 10 см3 дистиллированной воды, прибавляют 20 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного его растворения, затем приливают остальное количество – до 100 см3 дистиллированной воды.