Раствор серноватистокислого натрия (тиосульфата, гипосульфита)
50 г химически чистого кристаллического серноватистокислого натрия (тиосульфата, гипосульфита) доливают до 100 см3 дистиллированной водой, стерилизуют кипячением в течение 30 мин.
Селенитовая среда Лейфсона
Для приготовления среды готовят два раствора: А и Б.
Раствор А состоит из 5 г пептона, 7 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия (гидрофосфата), 3 г однозамещенного фосфорнокислого натрия (дигидрофосфата), 4 г химически чистой лактозы, 1 дм3 дистиллированной воды, рН (7,0±0,1). Компоненты смешивают, разливают в стерильную посуду по 225 см3 и стерилизуют текучим паром по 30 мин или при (112 ± 1)°С в течение 30 мин.
В раствор Б входит 10 %-ный раствор кислого селенистокислого натрия, приготовленного на стерильной дистиллированной воде (готовят перед употреблением).
Перед начатом работа к 225 см3 раствора А стерильно добавляют 9 см3 раствора Б.
Магниевая (хлористо-магниевая) среда
Среда состоит из трех растворов.
Раствор I: пептон – 4,2 г, натрия хлорид – 7,15 г, калия дигидрофосфат 1,48 г, дрожжевой диализат – 9 см3 (производство ИЭИМ АМН им. Н.Ф. Гамалея), вода дистиллированная – 890 см3.
Раствор II: магния хлорид – 35,7 г, вода дистиллированная – 90 см3.
Раствор III: бриллиантовый зеленый 0,5 %-ный, водный раствор – 0,9 см3.
Все три приготовленных раствора смешивают, разливают в колбы, флаконы, пробирки. Стерилизуют при (112±1)°С 30 мин.
При отсутствии дрожжевого диализата (производство ИЭИМ АМН им. Н.Ф. Гамалея) допускается замена его дрожжевым экстрактом.
Среда Крумвиде-Олькеницкого (трехсахарный агар с мочевиной)
Агар питательный сухой – 25 г, лактоза – 10 г, сахароза – 10 г, глюкоза 1 г, аммоний-железо (III) сульфат (соль Мора) (FeSO4 (NH4)2O·6Н2O) – 0,2 г, натрия тиосульфат (гипосульфит, серноватистокислый натрий) – 0,3 г, мочевина – 10 г, феноловый красный 0,4 %-ный водный раствор – 4 см3, вода дистиллированная – 1 дм3.
Соли предварительно растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в небольших объемах воды при подогревании на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают рН (7,3±0,1), добавляют индикатор и разливают в стеклянные пробирки по 6 7 см3.Среду стерилизуют при температуре (112±1)°С в течение 20 мин, скашивают, оставляя столбик 2 – 2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета. Среду хранят при комнатной температуре не более 7 сут.
Дрожжевой экстракт
100 г измельченных прессованных дрожжей заливают 1 дм3 дистиллированной воды, кипятят при постоянном перемешивании до тех пор, пока не сойдет пена, и помешают па 24 ч при (5±1)°С в холодильник. Затем эмульсию фильтруют через вату и фильтрат стерилизуют 20 мин при (121±1)°С.
5 см3 жидкого дрожжевого экстракта равноценны 1 г дрожжевого экстракта в порошке.
Солевой бульон
1 дм3 мясо-пептонного бульона и 6,5 г хлористого натрия смешивают в колбе вместимостью 2 дм3,разливают в пробирки по 10 см3. Стерилизуют (20±1) мин в автоклаве при температуре (121±1)°С. Хранят не более 28 сут при температуре (4±1)°С.
Желточно-солевой агар
К приготовленному 1 дм3 солевого бульона добавляют 20 г питательного агара, расплавляют на водяной бане, при необходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают мерным цилиндром по 100 см3 в колбы вместимостью 250 см3 и стерилизуют при (121±1)°С в течение 30 мин. Получают солевой агар. Вместо солевого бульона можно использовать, как основу, сухой питательный агар, мясо-пептонный бульон, бульон Хотгингера, добавляя 65 г хлористого натрия.
Для приготовления желточной эмульсии на дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, тщательно протирают его ватой, смоченной этиловым спиртом, и обжигают. Стерильным пинцетом пробивают с двух противоположных сторон яйца два отверстия, через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу вместимостью 200 см3. К желтку постепенно добавляют (частями по 20–30 см3) 200 см3 стерильного изотонического раствора, содержимое тщательно встряхивают до получения гомогенной массы.
Для приготовления желточно-солевого агара на 1 дм3 стерильного расплавленного и остуженного до (45±1)°С солевого агара добавляют 200 см3 желточной эмульсии, после полного размешивания желточно-солевой агар разливают в стерильные чашки Петри по 20–25 см3 и хранят в холодильнике до 5–7 сут.
Приготовление реактива Эрлиха
В 50 см3 этилового спирта с массовой долей 96% растворяют 4 г парадиметиламидобензальдегида, затем медленно добавляют 50 см3 концентрированной соляной кислоты. Реактив хранят в склянке из темного стекла при температуре 4–8°С.
Бумага индикаторная для обнаружения индола
Листы фильтровальной бумаги и обильно смачивают горячим насыщенным (12%) раствором щавелевой кислоты, высушивают при температуре (23±2)°С, затем нарезают полосками шириной 0,2–0,4 мм, длиной 5 – 6 см и хранят в банках темного стекла под пробками.
Карболовый раствор кристаллического фиолетового или генциан фиолетового
1г кристаллического фиолетового или генциан фиолетового растирают в фарфоровой ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты (фенола). Во время растирания небольшими порциями приливают 10 см3 этилового спирта с массовой долей 96%. Раствор фильтруют через влажный бумажный фильтр. Растворы генциан фиолетового или кристаллического фиолетового нестойки, длительному хранению не подлежат.
Красящие бумажки с кристаллическим фиолетовым или генциан фиолетовым для окраски по Граму, в модификации Синева
Кристаллического фиолетового или генциан фиолетового – 1 г, спирта этилового с массовой долей 96% – 100 см3, глицерина – 5 см3 смешивают, наливают в лоток или глубокую тарелку. Бумаг нарезают в виде полосок шириной 2 – 2,5 см и длиной 30 – 50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краситель так, чтобы смачивались обе ее поверхности. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают красителю стечь и подвешивают на веревке для высушивания. Бумагу сушат в термостате при температуре (37±1)°С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2˟2 или 2˟4,5 см.
Раствор Люголя для окраски мазков по Граму
2 г йодида калия растворяют в 10 см3 дистиллированной воды, прибавляют 1 г кристаллического йода, оставляют на несколько часов до полного растворения йода, после чего доливают 290 см3 дистиллированной воды. Раствор хранят в химической посуде из темного стекла.
Фуксин Циля – карболовый раствор
1 г порошка фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см3 (несколько капель) глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 этилового спирта с массовой долей 96%. После того, как смесь полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см3 дистиллированной воды, выдерживают 2 сут, после чего фильтруют. Фуксин Циля стойкий, хранится долгое время во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.
Фуксин Пфейфера, спирто-водный раствор
К 1 части карболового раствора фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды. Раствор очень нестойкий, поэтому его готовят в необходимых количествах непосредственно перед использованием.
Сухие среды: питательный агар, висмут-сульфитный агар, Гисса, дрожжевой экстракт, Кесслер. желчь крупного рогатого скота, мясо-пептонный бульон, Плоскирева, селенитовую, Хейфеца, агар Эндо, агар Клиглера готовят по прописи, указанной на этикетке.
Приготовление мазков по методу Грома
Приготовление мазков из культуры в агаризованной среде
На середину чистого обезжиренного предметного стекла стерильной пипеткой или петлей наносят небольшую каплю стерильного изотонического раствора или водопроводной воды. Затем, соблюдая правила асептики, петлей с плотной питательной средой из пробирки или чашки берут испытуемую колонию. Часть ее погружают в каплю, слегка растирая в ней, а остаток в петле сжигают на пламени горелки. Остуженной петлей сначала краем, а потом всей плоскостью петли равномерными круговыми движениями распределяют каплю на площади, составляющей примерно 1/3 предметного стекла.
При приготовлении препарата из культуры в жидкой питательной среде бактериологической петлей или пастеровской пипеткой берут каплю культуры и, поместив ее на середину сухого чистого стекла, равномерно распределяют ее в форме мазка. Петлю тотчас же обжигают на пламени горелки, а пастеровскую пипетку погружают в дезинфицирующий раствор.
Приготовленные мазки высушивают при комнатной температуре на воздухе.
Высушенные мазки фиксируют, для чего препарат берут пинцетом за край стекла мазком вверх и несколько раз проводят его через пламя горелки.
Окраска мазков
На предварительно фиксированный пламенем мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной кристаллическим фиолетовым или генциан фиолетовым, и на последнюю наливают дистиллированную воду так, чтобы бумажка полностью смочилась краской. Прокрашивание длится 1–2 мни.
Фильтровальную бумажку снимают пинцетом, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают на него раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.
Раствор Люголя сливают, предметное стекаю для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик с этиловым спиртом с массовой долей 96%. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости. Мазок можно обесцвечивать и таким способом: на препарат начинают этиловый ректификованный спирт с массовой долей 96% на 30 – 60 с, при этом препарат покачивают и доливают спирт.