Методы исследования свойств яиц и производных от них пищевых продуктов (стр. 8 из 10)
Препарат тщательно промывают водопроводной водой и докрашивают спиртоводным раствором фуксина (Пфейфера) или 1 %-ным водным раствором нейтрального красного в течение 1–2 мин. Краску сливают, мазок промывают водопроводной водой, сушат на воздухе или фильтровальной бумагой и микроскопируют. При этом учитывают морфологические особенности изучаемых бактерий и их отношение к окраске: грамположительные бактерии окрашиваются основной краской в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-розовый цвет.
Порядок проведения контроля
Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
Метод основан на подсчете всех колоний мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, вырастающих на плотном питательном агаре, и пересчете их количества на 1 г сухого (1 см3 жидкого) яичного продукта.
Проведение контроля
По 1 см3 исследуемого продукта из приготовленных разведений, высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают, и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 мин после внесения исследуемого материала в чашки его заливают 15 – 20 см3 предварительно расплавленного и охлажденного до (45±1)°С питательного или мясо-пептонного агара. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды. Чашки с посевами, перевернутые вверх дном, инкубируют в термостате при температуре (30±1)°С в течение (72±3) ч.
Обработка результатов
Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Подсчет микроорганизмов
Для подсчета количества микроорганизмов учитывают все выросшие колонии, отмечая стеклографом по дну чашки. Подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) проводят невооруженным глазом или с помощью лупы, или с помощью специально предназначенного для подсчета колоний прибора.
Подсчет проводят в посевах того разведения, количество колоний в котором в пределах 30 – 300. По результатам подсчета вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний из всех посевов одного разведения.
Если 30 – 300 колоний в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведений, то подсчитывают и вычисляют среднее арифметическое количество микроорганизмов в каждом из этих разведений отдельно. Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем в 2 раза, то оценку проводят по результатам посева наибольшего разведения.
Полученные результаты округляют следующим образом:
если инкубированные чашки не содержат колоний, то результат выражают так: меньше чем 1,0˟10 микроорганизмов в 1 см3 или 1 г продукта;
если в чашках с разведением 1:10 выросло меньше чем 30 колоний, то результат выражают так: меньше чем 3,0˟10;
если число выросших колоний меньше 100, его округляют до ближайшего числа, кратного 5;
если число больше 100 и его последняя цифра 5, его округляют до ближайшего числа, кратного 20;
если число больше 100 и его последняя цифра не 5, его округляют до ближайшего числа, кратного 10.
Количество микроорганизмов КОЕ Х в 1 г или в 1 см3 яичных продуктов вычисляют по формуле
Х =
,где а – округленное среднее арифметическое чисто колоний на чашках;
V – объем посевного материала, внесенного в чашку, см3;
n – степень десятикратного разведения продукта.
Результаты исследований записывают следующим образом: количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов 1.0х 10 КОЕ/г (см3) и т.д. до 9,9 ж 10 КОЕ/г (см3) продукта.
Метод определения бактерии группы кишечных палочек
Метод основан на способности бактерий группы кишечных палочек ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа.
Проведение контроля
По 1 см3 из разведений сухих или жидких яичных продуктов, вносят в пробирки со средой Кесслер или Хейфеца. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±1) ч. Из пробирок с признаками роста (изменение цвета среды, помутнение, газообразование) делают высев на среду Эндо. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±1) ч. Затем посевы просматривают и отмечают рост колоний, характерных для бактерий группы кишечных палочек (плоские пли слегка выпуклые, или с валиком, красные с различной интенсивностью окраски, розовые, бледно-розовые с металлическим или без металлического блеска). Из не менее чем трех характерных колоний готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Обработка результатов
Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
Обнаружение на среде Эндо характерного роста колоний, наличие в мазках из этих колоний грамотрицательных палочек, сбраживающих лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (37± 1)°С, указывают на выявление в продукте бактерий группы кишечных палочек.
Результат записывают как «не обнаружены» или «обнаружены» бактерии группы кишечных палочек в 0,1 см3 жидких или в 0,1 г сухих яичных продуктов.
Метод выявления бактерий рода Salmonellae
Метод основан на использовании сред обогощения с последующим выделением сальмонелл на дифференциально-диагностических средах, а также на изучении культурно-морфологических, биохимических и серологических свойств культур.
Проведение анализа
25 г сухих или 25 см3 жидких яичных продуктов из средней пробы с соблюдением стерильности вносят в колбу, содержащую 225 см3 одной из сред обогащения (Кауфмана, магниевой или селенитовой), встряхивают и инкубируют при температуре (37± 1)°С в течение 16 – 20 ч. Затем проводят высев бактериологической петлей (диаметр 0,4 – 0,5 мм) из сред обогащения в чашки Петри с висмут-сульфитным агаром или средой Плоскирева, или агаром Левина, растирая шпателем. Чашки с посевом инкубируют при температуре (37± 1)°С. Учет результатов проводят на висмут-сульфитном агаре через 48 ч, на среде Плоскирева и Левина через 18 – 24 ч. Сальмонеллы на висмут-сульфитномагаре образуют чёрные колонии с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в чёрный цвет участка среды под колонией и нежные светло-зеленые колонии. На средах Плоскирева и Эндо колонии сальмонелл прозрачные, на среде Левина голубоватые. При отсутствии типичных или подозрительных колоний или при наличии слабого роста микробов на плотных дифференциальных средах чашки с посевами повторно инкубируют при температуре (37± 1)°С в течение 20 -24 ч. Затем снова определяют присутствие колоний сальмонелл. При обнаружении подозрительных колоний продолжают исследование. В противном случае работу с посевами прекращают.
При наличии подозрительных типичных, характерных для сальмонелл колоний, из них берут не менее 3 колоний. Если имеется на одной чашке менее 3 типичных колоний, то берут все выросшие подозрительные колонии для пересева в пробирки: со скошенным питательным или мясо-пептонным бульоном, с пептонной водой и на одну из дифференциальных сред Ресселя, Крумвиде-Олькенйцкого, Клигера.
Среды Ресселя, Клигера засеивают сначала штрихом на скошенную поверхность, а затем уколом в глубину столбика.
Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 24±1) ч.
Выросшие культуры с поверхности скошенного агара используют для постановки реакции аггютинации и приготовления мазков. Мазки окрашивают по Грамму и микроскопируют. Сальмонеллы – отрицательные палочки. Посевы на мясо-пептидном бульоне и пептонной воде используют для определения способности выделенных культур образовывать сероводород и индол.
Подтверждение наличия сальмонелл в продукт даёт рост на средах Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера.
На срелах Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера оценивают окраску и газообразование. При росте сальмонелл в средах Ресселя, Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера в малиновый цвет окрашивается столбик (за счет расщепления глюкозы), скошенная часть среды остается бледно-розовой при отсутствии расщепления лактозы, сахарозы или обоих сахаров. Газообразование устанавливают по трещинам и разрывам столбиков агара. На средах Крумвиде-Олькеницкого, Клиглера образование сероводорода обнаруживают на основании почернения среды (от тёмной линии по месту протокола среды до разлитого почернения всего столбика). Расщепление мочевины выявляется по восстановлению первоначального цвета (бледно-розового) столбика среды.
Сальмонеллы мочевину не разлагают, сероводород образуют.
При необходимости более полной биохимической характеристики культуры пересеивают на цветные среды Гисса с углеводами («короткий пестрый ряд» с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой) и определяют их способность образовывать индол и сероводород.
С этой целью суточную культуру, взятую со скошенного питательного или мясо-пептонного агара, растирают в 1,0 см3 физиологического раствора. Затем по 2 капли (0,2 см3) взвеси вносят пастеровской пипеткой в среды Гисса, пептонную воду или мясо-пептонный бульон. Питательные среды с посевами инкубируют при температуре (37±1)°С.
На средах Гисса через 24 ч термостатирования учитывают кислотообразование (среды приобретают розово-красный цвет) и газообразование (наличие пузырьков в поплавках).
Сальмонеллы не ферментируют лактозу и сахарозу, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа.
Для обнаружения индола в пробирку с мясо-пептонным бульоном или пептонной водой сразу же после посева испытуемой культуры помещают полоску фильтровальной бумаги, смоченную насыщенным водным раствором щавелевой кислоты. Бумажку помешают таким образом, чтобы она удерживалась пробкой, но не прикасалась к среде. При наличии индола через 1 – 3 дня инкубирования при температуре (37±1)°С нижняя часть бумажки окрашивается в розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете. Индол можно определить и другим способом: в пробирку с суточной бульонной культурой осторожно по стенке добавляют 5 – 10 капель реактива Эрлиха. Перед добавлением реактива к бульону можно ввести 2 см3 этилового эфира. При наличии индола не позднее чем через 5 мин в пограничном слое образуется ярко-красное кольцо. Сальмонеллы индола не образуют.