Смекни!
smekni.com

Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов (стр. 8 из 11)

4.4 Характеристика предприятия

Харьковский биотехнологический центр расположен на восточной окраине города Харькова на территории ПО «Кулиничи».

В центре имеются: административный и лабораторный корпус, в котором находятся научные лаборатории и манеж для работы с животными, а также гараж для автотранспорта организации. Также имеется животноводческое помещение, в котором находятся 8 быков – производителей и хранятся корма для животных.

ХБТЦ является структурным подразделением Украинской академии аграрных наук, является юридическим лицом, имеет расчетный счет в банке, имеет свою печать и бланки с название организации.

ХБТЦ является координирующим центром по биотехнологии воспроизводства сельскохозяйственных животных на Украине.

Основное направление деятельности центра – разработка и внедрение новых научно обоснованных методов по повышению уровня воспроизводства сельскохозяйственных животных.

Центр выполняет задания Академии аграрных наук Украины, Министерства аграрной политики Украины, Министерства науки Украины по разработке новых технологий в области искусственного осеменения, криоконсервации, микрохирургии, клеточной и генной инженерии и трансплантации ооцитов и эмбрионов сельскохозяйственных животных, а также занимается хозрасчетной деятельностью, работая по договорам с сельскохозяйственными предприятиями в сфере воспроизводства стада.

Научные исследования проводятся на базе опытных хозяйств института животноводства УААН.

Собственных земельных угодий ХБТЦ не имеет.

4.5 Результаты исследований

4.5.1 Разработка мер предупреждения микробной контаминации эмбрионов на технологических этапах их подготовки

При изучении бактериальной загрязненности половых путей реципиентов в разные фазы полового цикла нами установлено, что в лютеальную фазу микробная контаминация выше, чем в эстральную, т.е. в это время матка наиболее чувствительна к микробному фактору. Кроме этого, нами доказано отрицательное влияние микробного фактора на приживляемость. Поэтому возникла необходимость в разработке мер предотвращению микробной контаминации на всех этапах трансплантации.

С целью предупреждения заноса инфекции в матку реципиента контаминированными эмбрионами на всех этапах трансплантации осуществляли бактериологический контроль. Бактериологические исследования показали, что промывные буферные среды содержат большое количество микроорганизмов, которые могут абсорбироваться на зоне пеллюцида эмбриона, а в дальнейшем при пересадке его переносится в матку реципиента. Поэтому мы считаем, что важным моментом в комплексе профилактических мероприятий микробной контаминации при трансплантации эмбрионов является санация промывных буферных сред и отмывка эмбрионов. Для санации промывных буферных сред и отмывки эмбрионов мы испытали различные комплексы антибиотиков. Контролем служили пробы. отобранные из промывных буферных сред и сред из чашек после отмывки эмбрионов без антибиотиков. Для исследований использовали чистые культуры микроорганизмов, ранее выделенные из половых путей коров и телок, а также промывных сред матки доноров. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что в сравнительных опытах по санации промывных буферных сред с инокулированными чистыми культурами в разведении 1:10 микробных тел/мл использовали комплексы антибиотиков: пенициллин (100 Ед/мл) + гентамицин (4,6,10 и 12 мкг/мл); ампициллин + гентамицин в тех же концентрациях; пенициллин (100 Ед/мл) + стрептомицин (50 Ед/мл).

Результаты бактериологических исследований после инокуляции культур и добавления антибиотиков через 1,5-2 часа показали, что к комбинациям пенициллин + гентамицин в концентрациях 100 Ед/мл и 12 мкг/мл и ампициллин + гентамицин в тех же концентрациях чувствительными оказались все взятые в опыт штаммы микроорганизмов. Концентрация гентамицина 4, б, 10 мкг/мл в комплексе с пенициллином (100 Ед/мл) значительно снижали рост микрофлоры, но полной бактерицидной активности не наблюдалось.

Комбинация пенициллина со стрептомицином, в указанных концентрациях, оказалась неэффективной против синегнойной палочки и испытуемого штамма кишечной палочки.

Для санации промывных буферных сред использовали комплекс антибиотиков гентамицин + ампициллин в концентрации 12 мкг/мл и 100 Ед/мл, предложенный А.Д. Бугровым и И.М. Величко (1986). Нашими исследованиями подтверждено, что лучшим антимикробным средством является вышеуказанная комбинация антибиотиков.


Таблица 1. Сравнительная активность комбинаций антибиотиков на чистые культуры микроорганизмов

Концентрация антибиотиков (мкг/мл и ЕД/мл) Культуры микроорганизмов Количество проб Рост микроорганизмов на питательных средах
МПА в чашках (кол-во колоний) МПБ Среда Булира
Гентамицин 4 Пенициллин 100 В. SubtilisPs. aeruginosaSt. aureusE. coli 4444 132–327132–327-- +-- -
Гентамицин 4 Ампициллин 100 B. subtilisPs. aeruginosaSt. aureusE. coli 4444 9–72-- +-- -
Гентамицин 6 Ампициллин 100 B. subtilisPs. AeruginosaSt. aureusE. coli 5555 ед.--- +--- ----
Гентамицин 10Ампициллин 100 B. subtilisPs. aeruginosaSt. aureusE. coli 2222 -ед.-- ---- ----
Гентамицин 12Пенициллин 100 B. subtilisPs. aeruginosaSt. aureusE. coli 4645 _--- _--- -
Гентамицин 12Ампициллин 100 B. subtilisPs. aeruginosaSt. aureusE. coli 4444 ---- ---- -
Пенициллин 100 Стрептомицин 30 B. subtilisPs. AeruginosaSt. aureusE. coli 5555 сп л. ростсп л. рост ++++ +

Примечание: (+) наличие роста, (–) отсутствие роста. В контроле без антибиотиков во всех пробах наблюдали рост вышеуказанных культур микроорганизмов.

В последствии нами проведен опыт. Результаты приведены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что из 14 смывов, санированных комплексом антибиотиков гентамицин-ампициллин в концентрациях 12 мкг/мл и 100 Ед/мл, соответственно, 12 – свободных от микроорганизмов, что составляет 85%. В контрольных смывах без добавления антибиотиков только 42,9% смывов стерильны. Различия в росте микроорганизмов на питательных средах из контрольных и опытных смывов достоверны (Р<0,001). Учитывая вышеизложенное, мы считаем целесообразным для санации промывных буферных сред использовать комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин в концентрации 12 мкг/мл и 100 Ед/мл.

Таблица 2. Действие комплекса антибиотиков гентамицин-ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл) на микрофлору промывных сред

Среды для вымывания эмбрионов Всего исследовано смывов Отсутствие роста микроорганизмов на питательных средах (МПБ, МПА)
Количество %
Гентамицин + ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл) (опыт) 14 12 85
Без антибиотиков (контроль) 14 6 42,9

Следовательно, из санированных промывных сред матки доноров большая вероятность получить деконтаминированные эмбрионы и предотвратить занос микроорганизмов в матку реципиента.

Полученые нами, промывные маточные среды от коров-доноров оценивали по внешним признакам: цвету, прозрачности. Из 14 проб, в которые антибиотики не добавляли, в 8 случаях (57,1%) отмечали рост микрофлоры на питательных средах и по внешнему виду они были мутными с примесями слизи. Это было основанием предположить, что в промывную маточную среду слизь могла попасть из влагалища или шейки матки, а также из матки при наличии скрытого эндометрита. Добавление антибиотиков в промывные буферные Среды снижали их бактериальную загрязненность и профилактировали эндометриты.

Кроме этого, санированная промывная среда профилактирует возникновение эндометритов при многократном использовании доноров. Микроорганизмы, попадая в микротравмы при извлечении эмбрионов, могут вызвать эндометриты. Об этом свидетельствуют данные В.И. Завирюхи, С.П. Хомина и соавт. (1987). Проведенный ими анализ практической работы показывает, что после проведения нескольких вымываний у коров-доноров развивается гнойной эндометрит.

Наши исследования по санации промывных буферных сред комплексом антибиотиков ампицилин+гентамицин доказывают, что даже при многократном использовании коров-доноров на питательных средах (МПБ и МПА) из проб промывных буферных сред, наблюдается незначительный рост микрофлоры. У отдельных коров-доноров эмбрионы извлекали по 3–4 раза, тем не менее, ни у одного из них эндометрита не наблюдали.

Это свидетельствует о том, что санация промывных буферных сред является средством профилактики заболеваний матки у коров-доноров.

В последние годы многие исследователи стали предлагать отмывку эмбрионов в нескольких стерильных средах, что по их мнению снижает концентрацию вирусов и бактерий в среде до неопасного субинфекционного уровня уже после третьего разбавления (E. Singh et al., 1982; D. Stringfellow et al., 1984). Для дополнительной гарантии полного блокирования случайной инфекции стали добавлять в стерильные среды антибиотики, либо обрабатывать эмбрионы ферментами (трипсином) (E. Singh et al., 1982).

Наши микробиологические исследования показали, что даже многократная отмывка эмбрионов стерильной фосфатно-буферной средой не всегда дает положительный антимикробный эффект. Так, при многократном отмывании эмбрионов стерильными средами до пятой чашки из 25 исследованных нами проб, в 3-х наблюдали рост микрофлоры на питательных средах. Для обеспечения стерильности эмбрионов нами было испытано многократное отмывание их в стерильных буферных средах с добавлением антибиотика гентамицина (12 мкг/мл) в комплексе с ампициллином (100 Ед/мл). Установлено эффективное антимикробное действие этого комплекса антибиотиков (табл. 3). Хотя различия между контролем и опытом не достоверны, существует тенденция к снижению роста микроорганизмов в средах для отмывки эмбрионов, что позволяло получить стерильный пересадочный материал.