Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири (стр. 8 из 20)
Таблица 3 Структура семейного материала выборки изученной по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN
| Выборка | Количество детей в семье | Всего | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Полные семьи (изучены оба родителя и дети) | 19(57) | 0 | 0 | 0 | 1(7) | 20(64) |
| Неполные семьи (изучен один родитель и дети) | 16(32) | 1(3) | 0 | 0 | 0 | 17(35) |
| Нет данных о родителях | 0 | 5(10) | 0 | 0 | 0 | 5(10) |
Примечание. В скобках указано количество индивидов.
Часть пробандов–детей составили мальчики (n=10), а девочек было в 1,5 раза больше (n=15). Средний возраст пробандов–детей разного пола достоверно не различался (7,2 года у мальчиков и 7,5 лет у девочек). Среди взрослых пробандов было 7 женщин (средний возраст – 19,8 лет) и 10 мужчин (средний возраст – 23,9 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз туберкулеза, причем первичный и вторичный генез заболевания встречался с одинаковой частотой. Среди обследованных родственников пробандов первой степени родства было 28 лиц мужского пола, из них 8 человек болели туберкулезом, и 39 -женского, из них с туберкулезом 14.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Клинико-лабораторные методы исследования
Клинико – эпидемиологический анализ больных туберкулезом включал: возраст начала заболевания, социальную категорию, вредные привычки (курение, злоупотребление алкоголем, употребление наркотиков), сопутствующую патологию, наличие контакта с туберкулезным больным, а также данные о туберкулезе у родственников больного. Анализу подвергались выраженность клинических проявлений (жалобы, объективный статус больного), результаты лабораторных и инструментальных методов исследования (микроскопия и посев мокроты на МБТ, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, рентгенологическое исследование легких, общий анализ крови) на момент начала заболевания.
Для решения задачи по оптимизации и стандартизации сбора информации о больном ТБ была разработана специальная карта "Унифицированный носитель информации", содержащая блоки, охватывающие сведения о жалобах больного, эпидемиологическом анамнезе, анамнезе заболевания, объективном статусе, результатах лабораторного и инструментального обследования. В дальнейшем на основании сведений из этих карт была создана электронная база данных в формате MicrosoftExcel.
2.2.2 Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов
Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов – кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) – трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т – консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A – транзиция в 13 интроне и D543N – неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне. Также выборки генотипировали по полиморфизму гена IL12В, обусловленному трансверсией аденина на цитозин в 3`-UTR области (табл. 4).
Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; LahiriD. etal., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20° С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5).
Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10´ буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq ДНК-полимеразы ("Сибэнзим", "Медиген", Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа "Эппендорф", наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах "MJRеsearch" (США) и "БИС 108" (Россия-Новосибирск).
Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94°С в течении 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60°С (1мин.), элонгации цепи при 72°С (40 сек.) и денатурации при 94°С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.5) при оптимальной для фермента температуре в течении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10´ буфера для рестрикции, поставляемого фирмой – производителем ("Сибэнзим", Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали в 3% агарозном геле при напряжении 120 В в течении 30 минут. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете.
Таблица 4Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN
| Ген | Полиморфизм | Выборка больных туберкулезом | Выборка здоровых индивидов |
| NRAMP1 | 469+14G/C | 279 | 137 |
| D543N | 278 | 139 | |
| 1465-85G/A | 279 | 135 | |
| 274C/T | 299 | 116 | |
| IL12B | 1188А/С | 279 | 129 |
| VDR | B/b | 293 | 108 |
| F/f | 298 | 113 | |
| IL1B | +3953A1/A2 | 301 | 139 |
| IL1RN | VNTR | 299 | 140 |
Таблица 5 Характеристики исследованных полиморфизмов
| Ген | Полимор-физм | Структура праймеров | tо отжига прай-меров, оС | Фермент рестрик-ции | Продукты гидролиза, п. н. | Литература | |||
| Аллель «дикого» типа | Мутантный аллель | ||||||||
 NRAMP1 | 274C/T | 5’-tgccaccatccctatacccag –3’ 5’-tctcgaaagtgtcccactcag –3’ | 60 | Mnl I | 167;37;12 bp | 102;65;37;12 bp | Liu J. et al., 1995 | ||
| 469+14G/C | 5’-tctctggctgaaggctctcc –3’ 5’-tgtgctatcagttgagcctc – 3’ | 60 | Apa I | 624 bp | 455;169 bp | ||||
| 1465-85G/A | 5’-gcaagttgaggagccaagac –3’ 5’-acctgcatcaactcctcttc –3’ | 60 | Bsе 1I | 142;75;24 bp | 102;75;40;24 bp | ||||
| D543N | 5’-gcatctccccaattcatggt –3’ 5’-aactgtcccactctatcctg –3’ | 60 | Bme 18I | 126;79;39 bp | 201;39 bp | ||||
| IL12 | A1188C | 5’-ttctatctgatttgcttta –3’ 5’-tgaaacattccatacatcc –3’ | 43 | Taq I | 233 bp | 165;68 bp | Hall M. A. еt al., 2000 | ||
| VDR | B/b | 5’-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3’ 5’-ggagaggagcctctgtcccatttg-3’ | 60 | Pct I | 813 bp | 505;308 bp | Wilkinson R.J. et al., 2000 | ||
| F/f | 5’-agctggccctggcactgactctgctct-3’ 5’-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3’ | 60 | Fok I | 267 bp | 197;70 bp | ||||
| IL1B | +3953A1/A2 | 5’-gttgtcatcagactttgacc-3’ 5’-ttcagttcatatggaccaga-3’ | 58 | Taq I | 220 bp | 148; 72 bp | Wilkinson R.J. et al., 1999 | ||
| IL1RN | VNTR | 5’-tcctggtctgcaggtaa-3’ 5’-ctcagcaacactcctat-3’ | 60 | А1-410 п.о. (4 повтора); А2-240 п.о. (2 повтора) А3-500 п.о. (5 повторов); А4-325 п.о. (3 повтора) А5-595 п.о. (6 повторов) | Tarlow J.K. et al., 1993 | ||||
2.2.3 Генетико – статистические методы анализа
Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера [Вейр Б., 1995]. Рассчитывали ожидаемую гетерозиготность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN [NeiM., 1975]. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле:
D=(hobs–hexp)/hexp,
где hobs и hexp – ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно.
Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с туберкулезом, а также с качественными патогенетически важными признаками заболевания, сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера. В дополнение к этому об ассоциации разных генотипов (или их комбинаций) с заболеванием судили по величине отношения шансов (oddsratio (OR)), которая показывает, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов) [PearceN., 1993].
OR= (A/B)/(C/D), где
А – число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе больных;
С - число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе здоровых;
В – число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе больных;
D - число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе здоровых.
Значения OR>1 указывают на возможную положительную ассоциацию с заболеванием. Обсуждение величин OR проводили при уровне значимости не более 5%.
На материале семейной выборки больных изучение ассоциаций полиморфизма исследованных генов с туберкулезом проводили с использованием теста на неравновесие при переносе (Transmission/DisequilibriumTest, TDT), который в случае диаллельного маркерного локуса М сводится к анализу таблицы сопряженности 2´2, где в ячейках матрицы суммированы случаи наследования и не наследования от родителей больными детьми маркерных аллелей [SpielmanR. S. etal., 1993].
a – число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1М1;