b – число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1М2;
c – число случаев наследования аллеля М2 от родителей М1М2;
d – число случаев наследования аллеля М2 от родителей М2М2;
Используются данные только от гетерозиготных родителей. Статистика теста рассчитывается по формуле:
TDT=(b-c)2/(b+c)
и в случае верной нулевой гипотезы (Н0: нет ассоциации) асимптотически распределена как χ2 с 1 степенью свободы.
С целью выявления ассоциации маркеров исследуемых генов с количественными, патогенетически важными признаками туберкулеза, проводили сравнение средних значений уровней метрических показателей у носителей разных генотипов с помощью однофакторного дисперсионного анализа по Фишеру и теста LSD. При наличии зависимости признака от пола показатели анализировались отдельно в группе мужчин и женщин. В случае влияния возраста на количественный параметр проводилась его корректировка, которая осуществлялась с помощью уровня линейной регрессии и рассчитывалась по формуле [Лильин Е.Т. и др., 1984]:
y=x+b(t0 -t),
где y – коррегированное значение исходной величины (х) признака;
t – возраст индивида
t0 – определенный возраст, к которому приводятся все значения;
b – коэффициент линейной регрессии признака по возрасту, который рассчитывается по формуле:
b=rxt/st2
где rxt – коэффициент корреляции признака с возрастом;
st- стандартное отклонение возраста в выборке.
Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и Лилифорса. В случае неравных дисперсий использовали непараметрические тесты Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и медианный тест [Лакин Г.Ф., 1990]. Сравнение дисперсий проводили по критерию Левене.
Расчеты гаметического неравновесия между парами молекулярно-генетических маркеров проводили по HillW. G. (1974). Все расчеты осуществляли с помощью программ "STATISTICAforWindows 6.0" и "MicrosoftExcel 7.0".
3. Результаты и обсуждение
Учитывая поставленные задачи, исследование включало три аспекта: изучение популяционной распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN, анализ связи исследованных генов с туберкулезом и поиск ассоциаций с патогенетически важными параметрами заболевания у русских жителей г. Томска. К настоящему времени получены результаты исследования аллельных вариантов генов подверженности к ТБ у тувинцев, выполненного по аналогичной схеме и с использованием того же набора полиморфизма генов [Рудко А.А. и др., 2003]. Это дало возможность провести сравнение полученных результатов между русскими жителями г. Томска и тувинцами.
3.1 Распространенность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN среди здоровых лиц (контрольная группа)
В настоящее время во многих популяциях мира достаточно широко исследованы полиморфные варианты гена NRAMP1, и в меньшей степени изучена распространенность аллелей генов VDR, IL12B, IL1B, IL1RN[Рудко А.А. и др., 2003; Имангулова М.М. и др., 2004; BellamyR. etal., 1998; RyuS. etal., 2000; CervinoA.C.L. etal., 2000;. Gao P. S., 2000; Baghdadi J. et al., 2004; Liu W. et al., 2004;]. Результаты исследований показали, что полиморфизм этих генов вносит вклад в возникновение туберкулеза.
Однако известно, что восприимчивость к инфекционному заболеванию определяется одновременно многими генами с различным вкладом каждого из них в формирование того или иного патологического фенотипа. К тому же, один и тот же ген может участвовать в формировании чувствительности (или резистентности) к нескольким инфекционным заболеваниям. Вероятно, для каждого гена (и их ансамблей) существует свое "поле действия", которое модифицируется средой [Пузырев В.П., 2000]. Сочетания генов предрасположенности к болезни могут быть неодинаковы в популяциях, обусловливая различия в подверженности к заболеванию у разных народов. В связи с этим перспективным направлением исследований генетических основ предрасположенности к туберкулезу является изучение вкладов конкретных сочетаний аллелей в подверженность к болезни в различающихся как по расовой, так и по этнической принадлежности популяциях.
У здоровых жителей г. Томска распределение генотипов по всем изученным полиморфным вариантам гена NRAMP1 (469+14G/C, D543N, 1465-85 G/A, 274 C/T), VDR(B/b, F/f), а также генов интерлейкинов (полиморфизм 1188A/C гена IL12B, полиморфизм +3953 A1/A2 гена IL1B) соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ), причем для большинства полиморфизмов наблюдаемая гетерозиготность (Hobs) превышала ожидаемую (Hexp) (табл.6). Лишь для частот генотипов VNTR полиморфизма гена IL1RN показано отклонение от ожидаемых при РХВ (χ2=16,75 р=0,010). При этом наблюдаемое количество гомозигот А2А2 превышало ожидаемое в 2,5 раза, а уровень гетерозиготности был меньше ожидаемого (D= –0,280). Возможно, этот факт объясняется тем, что анализируемая популяционная группа индивидов была выбрана не случайным образом из общей популяции, а включала только здоровых в отношении туберкулезной инфекции.
Сравнение распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RNу здоровых от туберкулеза русских и тувинцев показало статистически значимые отличия между этими этническими группами, которые имели место в распределении, как частот аллелей, так и генотипов по большинству изученных генов (табл. 7). Максимальные отличия между сравниваемыми этническими группами выявлены для полиморфизма B/b гена VDR, VNTR полиморфизма гена IL1RN и 1188А/С гена IL12B.
Таблица 6 Частоты аллелей и генотипов исследованных генов у здоровых жителей г. Томска
| Ген | Поли-морфизм | Гено-типы | N.O. | N.E. | Частота аллеля | χ2(df) | Hobs | Hexp | D |
| NRAMP1 | 469+14G/C | GGGCCC | 97382 | 98,2235,563,22 | G=0,847 | 0,44(1) | 0,277 | 0,260 | +0,069 |
| D543N | DDDNNN | 127120 | 127,2611,480,26 | D=0,957 | 0,01 (1) | 0,086 | 0,083 | +0,045 | |
| 1465-85G/A | GGGAAA | 734715 | 68,9855,0410,98 | G=0,715 | 2,60 (1) | 0,348 | 0,408 | -0,146 | |
| 274C/T | CCCTTT | 80342 | 81,1131,783,11 | C=0,836 | 0,37(1) | 0,293 | 0,274 | +0,070 | |
| IL12B | 1188A/C | AAACCC | 85431 | 87,9237,153,92 | A=0,826 | 2,75(1) | 0,333 | 0,288 | +0,157 |
| VDR | B/b | BBBbbb | 196326 | 23,6153,7730,61 | b=0,532 | 2,93(1) | 0,583 | 0,498 | +0,172 |
| F/f | FFFfff | 425417 | 42,1353,7317,13 | F=0,611 | 0,00(1) | 0,478 | 0,476 | +0,005 | |
| IL1B | +3953A1/A2 | A1A1A1A2A2A2 | 90445 | 90,2443,515,24 | A1=0,806 | 0,00(1) | 0,317 | 0,313 | +0,011 |
| IL1RN | VNTR | A1A1A1A2A1A3A1A4A2A2другие | 932743121 | 86,4940,943,962,204,841,57 | A1=0,786A2=0,186A3=0,018 | 16,8*(6) | 0,250 | 0,347 | -0,280 |
Примечание. N.O. и N.E. – наблюдаемая и ожидаемая численности генотипов соответственно; χ2 – критерий для сравнения ожидаемого и наблюдаемого распределения генотипов; d.f. – число степеней свободы; Hobs и Hexp – соответственно наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность; D – относительное отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой; * – p < 0,05
Таблица 7 Частоты аллелей и генотипов исследованных генов у русских жителей г. Томска и тувинцев
| Ген | Полимор-физм | Генотип / аллель | РусскиеN (%) | ТувинцыN (%) | p |
| NRAMP1 | 469+14 G/C | GGGCCC | 97 (70,8)38 (27,7)2 (1,5) | 224 (85,2) 36 (13,7)3 (1,1) | 0,002 |
| G | 0,847 | 0,920 | 0,002 | ||
| D543N | DDDNNN | 127 (91,4)12 (8,6)0 (0) | 198 (75,3)57 (21,7)8 (3) | 0,000 | |
| D | 0,957 | 0,861 | 0,000 | ||
| 1465-85 G/A | GGGAAA | 73 (54,1)47 (34,8)15 (11,1) | 162 (61,6)88 (33,5)13 (4,9) | 0,057 | |
| G | 0,715 | 0,783 | 0,040 | ||
| 274 C/T | CCCTTT | 80 (69)34 (29,3)2 (1,7) | 207 (78,7)49 (18,6)7 (2,7) | 0,072 | |
| C | 0,836 | 0,880 | 0,127 | ||
| IL12B | 1188 A/C | AAACCC | 85 (65,9)43 (33,3)1 (0,8) | 104 (39,5)119 (45,3)40 (15,2) | 0,000 |
| A | 0,826 | 0,622 | 0,000 | ||
| VDR | B/b | BBBbbb | 19 (17,6)63 (58,3)26 (24,1) | 2 (0,8)88 (33,5)173 (65,7) | 0,000 |
| b | 0,532 | 0,825 | 0,000 | ||
| F/f | FFFfff | 42 (37,2)54 (47,8)17 (15) | 148 (56,3)98 (37,3)17 (6,4) | 0,001 | |
| F | 0,611 | 0,749 | 0,000 | ||
| IL1B | +3953 A1/A2 | A1A1A1A2A2A2 | 90 (64,7)44 (31,7)5 (3,6) | 197 (74,9)61 (23,2)5 (1,9) | 0,086 |
| A1 | 0,806 | 0,865 | 0,035 | ||
| IL1RN | VNTR | A1A1A1A2A2A2другие | 93 (66,4)27 (19,3)12 (8,6)8 (5,7) | 190 (72,5)31 (11,8)1 (0,4)40 (15,3) | 0,000 |
| A1A2A3 | 0,7860,1860,018 | 0,8490,0690,013 | 0,000 |
Примечание. N – численность лиц с соответствующими генотипами; р – достигнутый уровень значимости
У русских г. Томска по сравнению с тувинцами аллели b гена VDR и А1 гена IL1RN встречались реже, а аллель 1188А гена IL12B – чаще. Кроме того, рассматриваемые популяционные группы статистически значимо различались по частотам аллелей и генотипов полиморфизмов 469-14G/C, D543N гена NRAMP1 и F/f гена VDR. Так, у русских чаще, чем у тувинцев наблюдали аллель 543D и реже аллель 469+14G гена NRAMP1. Индивиды, гомозиготы и гетерозиготы по аллелю f гена VDR, чаще встречались среди жителей г. Томска. Распределение генотипов полиморфизма 1465-85G/A гена NRAMP1 и +3953A1/A2 гена IL1B в исследованных популяционных группах не отличалось, однако частоты аллелей этих полиморфизмов были статистически значимо ниже у русских. Лишь для варианта 274С/Т гена NRAMP1 не найдено отличий по частотам аллелей и генотипов у русских и тувинцев.
К настоящему времени накоплены результаты многочисленных исследований роли генов-кандидатов туберкулеза в патогенезе заболевания у представителей различных этнических групп. Это позволило провести сравнительный анализ частот генотипов между русскими г. Томска и другими изученными популяциями мира. Найдены статистически значимые отличия русских от других этносов по частотам аллелей генов NRAMP1, VDR, IL12B (табл. 8).
Частота аллеля 469+14GNRAMP1 у жителей г. Томска оказалась статистически значимо ниже, чем у африканцев из Гамбии, но выше, чем у китайцев [BellamyR. etal., 1998; LiuW. etal., 2004]. Самым широко исследованным полиморфизмом гена NRAMP1 оказался D543N. Во все изученных популяциях этот генный маркер был низко полиморфным. Русские отличались по частоте аллелей D543N от коренных жителей Башкирии, у которых аллель 543N вообще не обнаружен [Имангулова М.М. и др., 2004]. При сравнении с другими исследованными популяциями (китайцы, корейцы, японцы, татары, гамбийцы) статистически значимых отличий для этого полиморфного варианта не показано (рис. 2, табл. 8) [ИмангуловаМ.М. идр., 2004; Bellamy R. et al., 1998; Ryu S. et al., 2000; Gao P. S. et al., 2000; Liu W. et al., 2004].