Національна академія наук України
Інститут біології клітини
Люта Мар’яна Ярославівна
УДК 616.379-008.64:612.111:[577.152.1.+577.112.4+547.477]
Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу
03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету
Львівського національного університету імені Івана Франка
Міністерство освіти і науки України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Сибірна Наталія Олександрівна,
Львівський національний університет
імені Івана Франка,
завідувач кафедри біохімії
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Великий Микола Миколайович,
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
пров. наук. співр. відділу біохімії коферментів
- доктор біологічних наук, професор
Янович Вадим Георгійович,
Інститут біології тварин УААН,
гол. наук. співр.
Захист відбудеться “ 20 ”лютого 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.
Автореферат розісланий “18” січня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук В.М. Убийвовк
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Цукровий діабет є однією з найголовніших медико-соціальних проблем і займає третє місце серед захворювань, які найчастіше є причиною ранньої інвалідності і летальності серед населення практично у всіх країнах світу [Gale, 2002]. Кількість хворих на ЦД у світі перевищила100 млн. осіб. У медичних закладах України на обліку їх біля 1 млн. Щорічно число хворих збільшується на 5-7%, а кожні 15 років – подвоюється [Томашевський, 1996].
ЦД 1-го типу є автоімунним захворюванням з деструкцією в-клітин острівців підшлункової залози, що розвивається під дією факторів зовнішнього середовища та при наявності генетичних передумов. Дана патологія супроводжується порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до формування ряду ускладнень. Незважаючи на велику кількість досліджень у цілому світі патогенез ЦД з’ясований не до кінця [Кураева и др., 2003]. У останній час головні завдання дослідників – перехід від діагностики діабету до його передбачення, від лікування до попередження.
Метаболічні порушення, які розвиваються внаслідок інсулінової недостатності при ЦД, значно ускладнюють функціонування систем підтримки гомеостазу, важливою ланкою якого є еритроцити периферичної крові. При ЦД суттєво змінюються фізичні, біохімічні, морфофункціональні властивості еритроцитів. За умов гіперглікемії глікозилювання гемоглобіну – основного білка червоних кров’яних клітин викликає зміну його спорідненості до кисню, посилення гіпоксії периферичних тканин у хворих на ЦД 1-го типу. Крім того, метаболічні процеси, індуковані глюкозою, проявляються активацією перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), що впливає на стабільність клітинної мембрани, адсорбцію на ній токсичних речовин, Це веде до порушень у обміні речовин, і, як наслідок, знижує життєздатність цих клітин [Бондарь и др., 2003]. В цілому зміни еритроцитарної ланки в комплексі метаболічних порушень у хворих ЦД вивчені недостатньо. Розуміння цих змін дозволить проводити адекватну фармакологічну корекцію при цьому захворюванні.
Відомо, що система L-аргінін/NO може брати участь у формуванні кисеньтранспортної системи крові, тобто впливати на основну функцію клітин еритрону через внутрішньоеритроцитарні механізми регуляції, кисеньзалежний характер утворення NO, підтримку судинного тонусу, дію пероксинітриту [Зинчук, 2003]. Вивчення її впливу на морфологічні та біохімічні показники еритроцитів за умов ЦД 1-го типу є надзвичайно актуальним, оскільки для цієї патології характерне посилення гіпоксії тканин пропорційно до розвитку діабетичних ускладнень.
Характер рівноваги між інтенсивністю вільнорадикальних процесів та функціонуванням системи антиоксидантного захисту значною мірою залежить від рівня продукування NO та депонування оксиду азоту в еритроцитах. Тому виникає потреба пошуку нових фармакологічних агентів, здатних коригувати розвиток цукрового діабету шляхом послаблення токсичної дії вільних радикалів кисню і азоту за умов даної патології. В цьому плані надзвичайно перспективним є застосування інгібіторів NO-синтаз селективної дії, які пригнічують, передусім, індуцибельну ізоформу фермента, що проявляє свої функції, в основному, за критичних умов.
З’ясування особливостей функціонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ), ферментів біосинтезу NO, механізмів депонування NO за допомогою гемоглобіну, та їх роль у регуляції морфофункціонального стану еритроцитів дозволить розширити наші уявлення про патогенез ЦД 1-го типу та механізми розвитку ускладнень за даної патології.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка згідно плану науково-дослідної роботи кафедри за темами: “Діагностика та розробка засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№ держреєстрації 0193U024092) і “Структурно-функціональні та біохімічні особливості клітин системи крові за умов цукрового діабету 1-го типу” (№ держреєстрації 0103U001909).
Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було з’ясування біохімічних механізмів впливу системи L-аргінін/NO на морфологічний та функціональний стан еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу та пошук шляхів корекції метаболічних порушень, які виникають при даній патології.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:
1. Оцінити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом.
2. Дослідити активність NO-синтази в еритроцитах щурів у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам peros субстрату даного ферменту (L-аргініну) та його інгібіторів (L-NAME (Nщ–nitro-L-arginine methyl ester) і аміногуанідину (AG)).
3. З метою дослідження процесів депонування NO вивчити динаміку вмісту лігандних форм гемоглобіну (Hb) в еритроцитах, кисень-зв’язуючу функцію основного пігмента крові, нітритредуктазну активність дезокси-Hb та процес нітрозування Hbinvitroв нормі, за умов експериментального ЦД та на фоні введення AG.
4. Проаналізувати електронні спектри нітрозил-Hb (NOHb) у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення AG для оцінки можливості моделювання коригуючого впливу на процеси депонування NO.
5. За допомогою скануючої електронної мікроскопії дослідити поверхневу архітектоніку та поліморфізм еритроцитів щурів при введенні L-аргініну, L-NAME та AGinvivo у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу.
6. З’ясувати вплив L-аргініну, L-NAME та аміногуанідину на стан системи антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів в еритроцитах контрольних тварин і на моделі експериментального стрептозотоцинового діабету.
Об'єкт дослiдження: біохімічні механізми, що опосередковують морфологічні та функціональні зміни в еритроцитах контрольних щурiв та тварин із експериментальним цукровим діабетом.
Предмет дослiдження: цитологічні та фізико-хімічні показники клітин еритроїдного ряду периферичної крові та кісткового мозку, ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та індуцибельна NO-синтаза), лігандні форми гемоглобіну, NO-похідні гемоглобіну (нітрозо- та нітрозилгемоглобін), нітритредуктазна активність дезоксигемоглобіну, ферментативна система антиоксидантного захисту (СОД, каталаза, ГПО, ГР), рівень продукції перекисного окислення ліпідів (ТБК-позитивні продукти).
Методи дослiдження: біохімічні, методи абсорбційної спектроскопії, скануючої електронної мікроскопії, цитологічні, статистичні.
Наукова новизна отриманих результатів. Отримані дані по вмісту фетального гемоглобіну, кількості еритроцитів у периферичній крові та добовій продукції і швидкості дозрівання ретикулоцитів у поєднанні з аналізом препаратів кісткового мозку ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.
Показано, що за умов експериментального ЦД значно зростає активність іNOS у еритроцитах.
Проведено аналіз лігандних форм гемоглобіну еритроцитів щурів у нормі та при ЦД 1-го типу на фоні введення аміногуанідину – інгібітора індуцибельної ізоформи NOS та процесів неферментативного глікозилювання. Показано, що за умов ЦД інтенсифікується процес S-нітрозилювання гемоглобіну.
Вперше показано коригуючий вплив аміногуанідину на кисеньтранспортну систему, активність ферментів антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів та морфофункціональний стан еритроцитів щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані по коригуючому впливу аміногуанідину на морфофункціональний стан еритроцитів (поліморфізм червоних кров’яних клітин, вміст глюкози та глікозильованого гемоглобіну, кисеньтранспортну функцію, активність ферментів системи антиоксидантного захисту, депонування NO шляхом нормалізації процесу S-нітрозилювання гемоглобіну) за умов ЦД 1-го типу вказують на доцільність його застосування в комплексній терапії та корекції ускладнень, що виникають при досліджуваній патології і на його основі вести пошук та розробку нових фармакологічних препаратів для лікування даного захворювання. Результати досліджень нітритредуктазної активності, процесів нітрозилювання та нітрозування дезоксигемоглобіну invitro та аналіз електронних спектрів нітрозилгемоглобіну дозволяють охарактеризувати механізми депонування NO за участю гемоглобіну та роль системи L-аргінін/NO у процесах формування адаптаційного захисту при ЦД.