Приклад 3
Розподіл розмірів часток в аерозолі лікарський засіб-ліпосоми.
Аеродинамічний розподіл розмірів часток в аерозолі лікарський засіб-ліпосоми визначається, як описано в Waldrep et al., J. of Aerosol Med. 7:1994 (1994), використовуючи самплер для визначення невидимих розмірів навколишніх часток Andersen 1 ACFM (Graseby Andersen Instruments Inc., Atlanta, GA) як імітатор легенів людини (Andersen). Аерозолі, що містять лікарський засіб-ліпосоми, вироблені з розпилювача ATII, збирали, використовуючи вакуумний насос (1 ACFM), вимірник удару при 8 етапах при стандартному часі дії в 0,5 хвилин для кожного експерименту. Концентрації лікарського засобу в краплях аерозолю з розміром 0-10 мкм збирали на кожному етапі (0=9, 0-10,0 мкм; 1=5, 8-9,0 мкм; 2=4, 7-5,8 мкм; 3=3, 3-4,7 мкм; 4= 2, 1-3,3 мкм; 5=1, 1-2,1 мкм; 6=0, 65-1,1 мкм; 7=0, 43-0,65 мкм) і визначали після елюїруванняз 10 мл етанолу або метанолу й аналізу за допомогою ВЕЖХ. USP штучне горло, з'єднане з вихідним отвором вимірника ударів, використовується для видалення аерозольних часток більш ніж 10 мкм. На кінцевій стадії використовується скляний фільтр, що збирає. Після визначення концентрації лікарського засобу на кожному етапі за допомогою ВЕЖХ аеродинамічний діаметр по медіані маси (MMAD) і геометричне стандартне відхилення (GSD) комплексу лікарський засіб-ліпосоми підраховується за графіком логарифмічної ймовірності, з ефективним граничним діаметром на осі ординат і кумулятивним відсотком менш, ніж діапазон розміру (по концентрації) як абсциса (KaleidaGraph 3,0). MMAD і GSD визначають по змісту лікарського засобу в ліпосомі, розподіленого в масиві крапель аерозолю (див. Waldrep et al. , Int'l J. of Pharmaceutics 97: 205-12 (1993)). Область крапель більш, ніж розмір ліпосом, визначає MMAD і GSD. Обґрунтованість цього способу визначення MMAD & GSD незалежно підтверджена при використанні Лазерного лічильника часток аерозолю, модель 3300 TSI.
Приклад 4
Оцінка вдихуваної дози.
Для визначення вдихуваної дози Bec-DLPC ліпосоми розпорошуються образцы, що, збирають у систему, що імітує легені людини, як описано Smaldone et al. , Am. Rev. Respir. Dis 143: 727-37 (1991). Використовуючи респіратор Харварда, аерозольні зразки з розпилювача ATII (швидкість потоку 10 л/хв) збирають у фільтри Whatman GF/F при 15 вдиханнях у мінуту при обсязі одного вдихання 500 мол. Цей основний обсяг одного вдихання, що становить 500 для чоловіків (450 для жінок), визначений по номограмі, пристосованої для обліку частоти подиху, ваги й полу. Аерозольні зразки збирали протягом п’ятнадцятихвилинного періоду розпилення. Кількість циклоспорину A або Будезоніду, що потрапили на фільтри, визначають після екстракції за допомогою ВЕЖХ.
Приклад 5
Аналізи легеневого циклоспорину A: Твердофазна екстракція
Здійснювалися наступні етапи:
1. Після вдихання циклоспорину A-DLPC у вигляді ліпосомного аерозолю виділяють тканина легенів миші. Додають внутрішній стандартний CSD 10 мкг (1 мкл 1/мг/мл вихідного розчину). Тканина гомогенізують або в змішувачі, або в пробірках Wig-L-Bug (використовуючи 4-5 кульок на пробірку).
2. Гомогенізовану тканину екстрагують в 1 мол надчистої води протягом 1-2 мінут. Цей обсяг використовують для одного зразка тканини, а при об'єднанні більш ніж одного зразка, його розбавляють.
3. Додають 2 мол 98-процентного ацетонітрілу/ 2-процентні метаноли й зразки енергійно струшують.
4. Зразки центрифугують на повній швидкості 20 ; супернатант переносять у чисту пробірку й центрифугують 10 хвилин на повній швидкості.
5. Супернатант збирають і додають по 5 мол надчистої води до кожному 1 мол тихорєцького екстракту.
6. Готовлять стовпчик Sep-Pak C18 (Waters Sep-Pak Light для одиничної мишачої тканини) і промивають 5 мл 95-процентного этанола й 5 мл надчистої води. Зразки додають повільно й промивають 5 мол надчистої води й 5 мол 50-процентного ацетонитрила.
7. Елюат переносять у складальну пробірку й елюірують 1 мл метанолу, а потім 0,5 мл води.
8. Забруднення видаляють при промиванні елюату двічі 1,5 мл гексану й відкиданням верхнього шару.
9. Екстрагований елюат випарюють до сухого стану з використанням температури регулювання реактивного середовища з мінімальним потоком повітря.
10. Відновлення проводять в 0,3 мл рухливі фази CSA і зразку у ВЕЖХ.
Приклад 6
Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз будезоніду.
Дослідження за допомогою ВЕЖХ застосовується з різними цілями для визначення: змісту Будезоніду в ліпосомній готовій препаративній формі, ефективності інкапсулірування, змісту Будезоніда в аерозольних зразках, отриманих на моделі легенів. Концентрацію Будезонида визначають за допомогою ВЕЖХ аналізу з використанням автозагрузочного пристрою Waters WISP 717 і стовпчика Waters Nova-Pak C18 (3,9 x 150 мм) при кімнатній температурі. Пік реєструють при 238 нм, використовуючи детектор, що працює при різних довжинах хвиль в УФ і видимої частини спектра з кількісною оцінкою за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Рухлива фаза, що використовується при цих дослідженнях, представляє 50:50 етанол/ метанол при швидкості потоку 0,6 мол у мінуту (див. Anderson & Ryrfeldt, J. Pharm. Pharmacol. 36: 763-65 (1984)). Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в етанолі (для розчинення ліпосом). Стандарти лікарського засобу готовлять із вихідного розчину етанолу, що зберігається при -80 0С.
Приклад 7
Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз циклоспорину A.
Циклоспорин A у ліпосомних готових препаративних формах (для визначення змісту циклоспорину A і ефективності інкапсулювання) і аерозольних зразках визначався за допомогою ВЕЖХ. У дослідженні використовувалися автоматичний інжектор зразків Waters (Milford, MA) WISP і стовпчик Supelco LC-1, нагріта до 750С. Рухлива фаза складалася з 50 відсотків ацетонітрілу, 20 відсотків метанолу й 30 відсотків води (див. Charles et al., Ther. Drug Monitor. 10: 97-100 (1988)). Пік реєструють при 214 нм, використовуючи детектор, що працює на різних довжинах хвиль, і кількісно оцінюють за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в метанолі (для розчинення ліпосом). Стандарти лікарського засобу одержують із вихідного розчину метанолу, що зберігається при -800С.
Приклад 8
Аналіз лікарського засобу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕЖХ): аналіз DLPC
Була використана модифікація схеми проведення ВЕЖХ Grit and Commelin, Chem. & Phys. of Lipids 62: 113-22 (1992). Застосовувалися автоматичний інжектор зразка Waters 717 WISP і колонка-аміно-стовпчик Sperisorb S5 (0,25 см х 4,6 мм, 5 мкм) з рухливою фазою: ацетонітрил, метанол і 10 мМ аміак/трифторуксусна кислота, p 4,8 (64:28:8 по обсязі). Піки реєструють за допомогою випарного-мас-випарного детектора (SEDEX 55, Sedre, France) і кількісно оцінюють за Версією 2,15 Millenium 2010 Chromatography Manager фірми Waters. Зразки для аналізу розчиняють безпосередньо в етанолі або метанолі (для розчинення ліпосом).
Приклад 9
Модель легенів для тестування лікарського засобу на мишах: дослідження гострого запалення: (LPS) техніка бронхіолярного лаважа
Ліпополісахарид стінки грамвідемної клітки (LPS) використовувався для індукції, що відновлює, гострого пульмонологического запалення в миші.10-хвилинна експозиція Е. coli 055:B5 LPS (Sigma) аерозолю, випущеного з розпилювача PBsj 1600 (концентрація в резервуарі 100 мкг/мол; доставлена доза 60 нг), викликала сильний флогістичну відповідь, що визначено шляхом акумуляції PMN в альвеолах у відповідь на вироблення хемотаксических цитокінів (визначно на 3 годині; пік відповіді на 6 годині після стимулу). У різний час після застосування аерозолю LPS мишей забивали під метоксифлурною анестезією й знекровлювали через абдомінальну аорту. У трахею хірургічним шляхом вставлялася канюля з PE50 трубкою (зовнішній діаметр 0,965 мм. Clay Adams). Використовуючи збалансований розчин солей по Хенксу в загальному обсязі 2,0 мл (HBSS; Ca/Mg вільний з EDTA), легені зрошували 5 мінут обсягом приблизно в 1,0 мол. Вихід звичайно становив 85 відсотків витягу лаважної рідини. Отримані в результаті білі клітки підраховували за допомогою гемоцитометру, піддавали цитоцентріфугуванню й офарблювали. По різних підрахунках ефект лікарського засобу відзначається по зниженню кількості білих кліток і по зменшенню кількості PNM і/або міелопероксидази позитивних кліток щодо постійних макрофагів і/або міелопероксидази негативних кліток. Це дослідження використовується як стандарт для тестування режиму дії аерозолів, що містять лікарський засіб/ліпосоми, на біологічну активність за допомогою зменшення гострого запального клітинного розростання дихальних шляхів. Фіг. 7 показує протизапальний ефект високих доз Bud-DLPC на легеневий бронхоальвеолярний лаваж (BAL) лейкоцитів у відповідь на виклик LPS (ендотоксину).
Приклад 10
Цитологія: легеневий лаваж Клітинні препарати (лаваж, тимоцити, лімфовузли або спленоцити) підраховувалися на гемоцитомітрі, піддавалися цитоцентрифугуванню на слайди (використовуючи Miles Cyto-Tek) і офарблювалися за допомогою Wright-Giemsa. May-Grunwald-Giemsa або лейкоцитарна пероксидаза прямо залежить від способу готування. Диференціальний підрахунок був зроблений шляхом мікроскопічного спостереження з масляної імерсії. Біологічний ефект режиму застосування аерозолю з комплексом лікарський засіб-ліпосоми відзначався по зниженню загальної кількості білих кліток і по зниженню числа PMN або міелопероксидази позитивних кліток щодо звичайних макрофагів.
Приклад 11
Інгібірувані антиген/мітоген індукованого лімфоцитарного бластогенезу in vitro за допомогою Cs, виділеного із тканини легенів миші, після аерозольної доставки Cs-DLPC ліпосом (див. табл.A)
Біологічна активність Cs, доставленого в легені з ліпосомним аерозолем. Первинна імунна відповідь для тестування була викликана в пов'язаній із бронхами лімфоїдної тканини й у пов'язаних з легенями медіастинальних лімфатичних вузлах. Після місцевої інтраназальної імунізації мишей лінії Balb/c обложеним квасцами яєчним альбуміном ( AP-OVA (80 мкг), доповнений вакциною Bordetella pertussis) мишей забивали через 7 днів, медіастинальну тканину видаляли й ізолювали лімфоцити для аналізу in vitro. Дослідження проліферації складається в зміні в стимулюванні лімфоцитів після активації сенсибілізіруючим антигеном яєчним білком або неспецифічним T-Клітинним мітогеном, Con А плюс з’єднаною з культурою Cs ізольований із тканини легенів миші при твердофазної екстракції при ВЕЖХ. Поглинання 3[H]-Td у ДНК визначалося протягом 48-72 годин. Інгібірування специфічної або неспецифічної активації лімфоцитів було продемонстровано шляхом знищення або зменшення антиген-специфічного стимулювання або в інгібірування нечутливості до мітогену.