Современная модификация метода извлечения подкисленным спиртом сводится к следующему. Тщательно измельченный объект (100—200 г внутренних органов трупа) помещают в толстостенную колбу или банку, заливают 96 этиловым спиртом так, чтобы были покрыты твердые части объекта, и подкисляют 10% спиртовым раствором виннокаменной (или щавелевой) кислоты.
Когда исследуемый объект подкислен, колбу, не закрывая, пробкой, встряхивают и спустя некоторое время (в неводных растворах и в гетерогенной среде время нейтрализации больше, чем в воде), содержимое испытывают реакцией на универсальный индикатор. Для этого каплю жидкости смешивают с каплей воды нейтральной реакции и смесью смачивают индикаторную бумагу — рН среды должен быть 2,5—3,0.
Пробирку закрывают неплотно (имеется в виду возможность, продолжения выделения некоторого количества угольного ангидрида), оставляют колбу на сутки в теплом месте (25—30°), часто перемешивая ее содержимое. Спустя сутки убеждаются в сохранении кислой реакции. Тогда спиртовую вытяжку сливают и заменяют новой порцией спирта. Если через сутки реакция, жидкости изменилась, стала нейтральной или щелочной, объект вновь подкисляют органической кислотой до рН 2,5—3,0 и снова оставляют на сутки. Операцию извлечения проводят 3—4 раза.
Спиртовые вытяжки соединяют вместе, а биологический материал промывают спиртом. Спирт присоединяют к слитым ранее порциям вытяжек. Извлечения отфильтровывают и сгущают до густоты сиропа под уменьшенным давлением или в фарфоровой чашке на водяной бане, имеющей температуру воды не выше 40° (во избежание разрушения таких веществ, как атропин, кокаин, и некоторых других соединений, имеющих характер сложных эфиров). Сиропообразную жидкость обрабатывают 96°, а еще лучше абсолютным спиртом, приливая его по каплям и перемешивая жидкость стеклянной палочкой. Спирт добавляют до тех пор, пока не прекратится осаждение белков.
Осторожное добавление спирта вызывает осаждение белковых, веществ в виде мелких хлопьев, не захватывающих раствора, что может иметь место при добавлении большого количества спирта сразу, когда осадок выделяется в виде больших сгустков.
Жидкость отстаивают, фильтруют, фильтр промывают спиртом и фильтрат упаривают до густоты сиропа при описанных выше условиях. В сиропообразном остатке снова осаждают белки, жидкость отстаивают и фильтруют. Операцию осаждения белков повторяют до тех пор, пока спирт перестанет что-либо осаждать. Тогда вытяжку упаривают до густоты сиропа и обрабатывают 20—25 мл воды. Если при этом образуется осадок, его отфильтровывают и тщательно промывают небольшим количеством воды.
Из водного раствора производят повторные извлечения (3—4 раза) небольшими порциями (по 10—15 мл) хлороформа сначала из кислой, а затем из щелочной (рН 10) среды. Подщелачивание производят 25% раствором аммиака.
Удобство применения хлороформа в качестве растворителя заключается в том, что он достаточно хорошо растворяет большинство токсикологически важных органических веществ из группы изолируемых подкисленным спиртом и легко отделяется от водного раствора.
Извлечение как из кислой, так и из щелочной жидкости должно производиться осторожно, лишь легким взбалтыванием или многократным перевертыванием делительной воронки, но отнюдь не энергичными встряхиваниями. Последние могут вызвать образование трудноразделимой эмульсии. Образовавшуюся эмульсию можно попытаться разрушить, добавив 0,5—1 мл спирта и поставив объект исследования в теплое место. Расслоение достигается при насыщении жидкости сульфатом аммония. Лучшим способом является центрифугирование.
Экстрагированием хлороформом сначала из кислого, а затем из щелочного раствора преследуется цель разделения веществ, изолируемых подкисленным спиртом, на две большие подгруппы: 1) подгруппа веществ, экстрагируемых хлороформом из кислого раствора; 2) подгруппа веществ, экстрагируемых хлороформом из щелочного раствора.
Экстрагирование хлороформом из кислого водного раствора, кроме того, ставит своей задачей очистку жидкости от жира, красящих, дубильных и других веществ, мешающих дальнейшему качественному обнаружению алкалоидов и других токсикологически важных веществ основного характера.
Из числа веществ, представляющих токсикологический интерес, хлороформ экстрагирует из кислого раствора: 1) кислоты и их производные; 2) многоатомные фенолы; 3) некоторые вещества нейтрального характера (полинитросоединения), производные анилина и парааминофенола; 4) слабые основания.
Все хлороформные извлечения из кислого раствора сливают вместе, фильтруют через возможно маленький фильтр и отдельные порции исследуют на наличие производных барбитуровой кислоты и таких слабых оснований, как стрихнин, бруцин, кофеин и др.
При наличии наводящих указаний (характерная окраска хлороформного извлечения или остатка по удалении растворителя, например в присутствии пикриновой кислоты, кристаллическое строение при наличии полинитропроизводных, фенацетина и т. п.), так же как и при специальных запросах, круг исследований в той или иной степени расширяется или суживается.
Практически в большинстве случаев бывает достаточно 3— 4-кратного экстрагирования. Хлороформные вытяжки из щелочного раствора также сливают вместе, промывают небольшим количеством воды, фильтруют через возможно маленький фильтр и хлороформ выпаривают при комнатной температуре в небольшой фарфоровой или стеклянной чашке. Остатки по удалении хлороформа исследуют на наличие алкалоидов и синтетических лекарственных веществ.
Достоинства и недостатки метода изолирования подкисленным спиртом. Удобство применения этилового спирта для изолирования разнообразных органических веществ из объектов биологического происхождения заключается в его способности хорошо растворять многие органические вещества, а также свертывать, переводить в нерастворимое состояние белки — главную составную часть большинства объектов химико-токсикологического исследования (внутренние органы трупов, пищевые продукты животного происхождения и т. п.). При этом неизбежны потери искомых веществ, так как свернувшийся белок удерживает ту или иную часть их.
Метод изолирования подкисленным спиртом обладает рядом недостатков, к числу которых относятся следующие:
а) длительность настаивания объектов со спиртом, а также упаривания спиртовых вытяжек и удаления осажденных белков; в общей сложности обработка занимает 8—10 рабочих дней и больше (в случае упаривания спиртовых вытяжек на теплой водяной бане в открытых фарфоровых чашках);
б) большое количество операций, связанных с очисткой спиртовой вытяжки от белков и продуктов белкового распада;
в) возможность потери малых количеств алкалоидов и других веществ основного характера как вследствие сорбции их белками и фильтровальной бумагой (особенно при многократном фильтровании), так и в результате продолжительного нагревания кислого раствора;
г) относительная дороговизна метода, так как на каждое исследование, например, внутренних органов трупа расходуется до 500 мл 96° этилового спирта. Все это приводит к тому, что классический метод Стаса—Отто как общий метод теряет свое значение и постепенно заменяется более быстрыми, эффективными и более экономичными методами, хотя он еще и сохраняет свою роль при изолировании некоторых веществ, плохо растворимых в воде, а также при исследовании биологических объектов в сильно гнилостном виде.
2.4.2.2. ИЗОЛИРОВАНИЕ ПОДКИСЛЕННОЙ ВОДОЙ
Метод изолирования подкисленной водой, предложенный Драгендорфом. Одним из описанных в литературе методов изолировании, главным образом алкалоидов, является метод Драгендорфа. Идея изолирования подкисленной водой высказывалась и до него рядом авторов, например Грэмом.
По методу Драгендорфа алкалоиды и некоторые вещества неалкалоидного характера 2—3 раза извлекали при температуре 40—50" водой, содержащей серную кислоту. Водные вытяжки упаривали до сиропообразной консистенции, настаивали с 3—4-кратным объемом 96° спирта в течение 24 часов при температуре 30° и фильтровали. Фильтр с целью очистки обрабатывали петролейным эфиром, а затем последовательно экстрагировали бензином, хлороформом и снова петролейным эфиром. После извлечений из кислого раствора водную жидкость подщелачивали раствором аммиака и снова последовательно экстрагировали бензином и амиловым спиртом. Метод имел ограниченное применение, так как он обладал рядом недостатков, главным из которых являлись упаривание сернокислой вытяжки на водяной бане до сиропообразной консистенции и применение нескольких органических растворителей. Эти операции могли привести к значительным потерям ряда алкалоидов.
Современная модификация метода извлечения подкисленной водой. В 1942 г. М. Д. Швайкова и А. В. Степанов для изолирования алкалоидов из объектов растительного происхождения предложили так называемый скоростной метод извлечения алкалоидов. В 1947 г. этот метод был применен А. А. Васильевой с целью изолирования алкалоидов из свежих внутренних органов трупа, а затем вошел в практику лабораторий.
В 1956—1961 гг. проф. В. Ф. Крамаренко и его сотрудники своими исследованиями показали необходимость учета рН среды как в процессе изолирования алкалоидов из биологического материала, так и при экстрагировании их органическими растворителями из водных вытяжек (стр. 126). При учете этих данных исследование объектов растительного происхождения (мука, хлеб, крупа и т. д.) на наличие в них алкалоидов производится следующим образом: 5 г исследуемого объекта тщательно смешивают с 60 мл дистиллированной воды1, подкисленной насыщенным водным раствором винной (или щавелевой) кислоты до рН 2,0—2,5 (по универсальному индикатору), и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Периодически смесь взбалтывают. Водный слой сливают декантацией и подвергают центрифугированию 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Прозрачную жидкость переносят в делительную воронку и трижды новыми порциями (по 15—20 мл) осторожно, чтобы избежать образования эмульсии, экстрагируют хлороформом. Для разделения эмульсия (в случае ее образования) пользуются центрифугированием. Хлороформную вытяжку исследуют на группу веществ, экстрагируемых из кислого раствора, а также и некоторые алкалоиды и вещества, обладающие слабо основными свойствами (кофеин, стрихнин, бруцин).