Участие аналогов убихинона в переносе электронов в дыхательной цепи митохондрий (стр. 11 из 12)
Липофильные катионы, несмотря на положительный заряд, имеют высокую растворимость в липидах, легко проходят через мембраны бислоя без участия ионофоров и аккумулируются в митохондриях в клетки, движимые высоким потенциалом митохондриальной мембраны. Подобное свойство обусловлено гораздо меньшей по сравнению с гидрофильными катионами типа Na+ энергией активации перехода иона из водной среды в липидное окружение. Эта энергия определяется электростатической и гидрофобной составляющими.
Основной вклад в электростатическую компоненту вносит энергия Бора, которая представляет собой вклад энтальпии, необходимый для удаления гидратирующих катион молекул воды при переносе в липидную фазу из водного раствора. Энергия Бора обратно пропорциональна ионному радиусу катиона, что обусловлено пониженной гидратацией катиона при распределении заряда по большей площади поверхности, которая в этом случае имеет меньшую напряженность электрического поля, поляризующего молекулы воды. Липофильные катионы представляет собой фосфоний, окруженный тремя гидрофобными фенильными группами, за счет чего имеют большойим ионныйм радиус около 4 Ǻ. Таким образом, включение в мембранный бислой липофильных катионов типа тетрафенилфосфония с большим ионным радиусом в 4, 2 Ǻ гораздо менее энергетически невыгодно, чем поглощение маленьких катионов типа Na+ с радиусом ~1 Ǻ.
Помимо энергии Бора существует еще две электростатических составляющих, но которые вносят значительно меньший вклад. Первая обусловлена электростатическими свойствами на границе раздела фаз с различной диэлектрической проницаемостью, а вторая связана с локальным электрическим потенциалом, возникающим во внутренней части мембраны благодаря ориентации диполей карбонильных групп жирных кислот в фосфолипидах. Существование этой дипольной силы объясняет факт о значительно более быстром проникновении анионов сквозь бислой по сравнению с катионами.
В целом электростатические силы препятствует переносу катиона из водной в липидную фазу. Однако существует не менее важная компонента энергии перемещения, обусловленная гидрофобностью катиона. Она способствует включению его в бислой за счет положительного гидрофобного эффекта, который заключается в повышении энтропии, связанном с нарушением структуры воды. Гидрофобный эффект оценивается примерно в 92 Дж/моль на Ǻ2 доступной растворителю поверхности, и, к примеру, для тетрафенилфосфония выигрыш в энергии составит порядка 29 кДж/моль. Помимо этого, гидрофобный эффект возникает сразу после поглощения катиона мембраной, тогда как увеличение отталкивающих электростатических сил возникает постепенно при прохождении через мембрану. Вследствие этого в энергетическом профиле перемещения катиона сквозь бислой помимо центрального энергетического барьера имеются потенциальные «ямы» рядом с поверхностью мембран. Катионы связываются с мембраной, попадают в потенциальную «яму» у поверхности и быстро проходят сквозь гидрофобный центр к противоположной потенциальной «яме», после чего десорбируются в раствор по другую сторону барьера. Таким образом, катионы находяться в динамическом равновесии между формами, связанными с поверхностью внутренней мембраны и свободными формами в растворе, при этом в связанном состоянии находиться примерно 60% ТРМР и 85% тетрафенилфосфония (ТРР). Т.е. в перемещении липофильных катионов через фосфолипидный бислой можно выделить три стадии: адсорбцию, транслокацию и десорбцию (рис.33).
Рисунок 33:Накопление MitoQ10 в митохондрии в ответ на мембранный потенциал Δψ.
Связывание производных трифенилфосфония происходит в большей степени по мере роста гидрофобности боковой цепи из-за увеличения движущей силы энтропийной природы. К примеру, константа ассоциации с бислоем увеличивается в 10 раз при пере-ходе от ТРМР к амилТРР и в 6 раз при переходе к тетраТРР. При этом для всех производных группа ТРР ассоциируется с мембраной в одном и том же положении на гидрофобной стороне раздела липид/вода при одновременном проникании боковой цепи в мембрану, поэтому даже самые гидрофобные производные ТРР быстро проходят сквозь бислой, не задерживаясь в нем из-за липофильности алкильной цепи. Это подтверждается коэффициентами распределения производных ТРР в системе октанол/фосфатный буфер, имитирующей внешний мембранный слой, которые относительно велики: 0,35 у ТРМР и 160 у MitoQ10. При этом коэффициент распределения в имитирующей середину бислоя с низкой диэлектрической постоянной системе циклогексан/вода для MitoQ10 незначителен.
Таким образом, в отсутствии мембранного потенциала в условиях деэнергизованных митохондрий катионы связываются с наружной стороной мембраны, затем преодолевают гидрофобный энергетический барьер липидного бислоя, сявзываются с внутренней стороной мембраны и, наконец, десорбируются в митохондриальный матрикс.
При наличии Δψ перемещение катионов через мембрану приводит к их накоплению в митохондриальном матриксе в соответствии с уравнением Нернста. При Δψ около 60 мВ концентрация катионов в матриксе увеличивается в 10 раз, а при митохондриальном Δψ в 140-180 мВ – в сотни раз (рис. 36).Мера накопления катионов в ответ на мембранный потенциал Δψ описывается уравнением Нернста, где z - это заряд на катион.
При этом уравнение Нернста оперирует концентрациями несвязанных катионов. Значительная часть проникших в митохондрии катионов ТРР связана с внутренней мембраной, что обусловлено большим объемом внутренней мембраны по сравнению с объемом матрикса. Повышение гидрофобности производного приводит к увеличению адсорбции.
Так, при 37°С до логарифмирования фактор равен 61мВ (для монокатионов), в то время как in vivo – приблизительно 120-180 мВ, а концентрация липофильных монокатионов увеличивается в 100-1000 раз внутри митохондрии (используется для измерения Δψ и обнаружения митохондрий в клетке) [76].
Рисунок 34: Адресная доставка в митохондрии с помощью катионов ТРР+ (by Murphy, 2004, [19]).
В свете описанных свойств катионов ТРР+, ковалентное присоединение незаряженных биологически активных соединений к катионам ТРР+ должно приводить к их адресной доставке внутрь митохондрий под действием высокого мембранного потенциала, что позволит исследовать различные вещества и использовать их в терапевтических целях. Рассмотрим некоторые производные хининов поподробнее.
Так аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами алкилтрифенилфосфо-ния, образуют молекулы MitoQ (рис.32), которые имеют различную длину боковой цепи.
Так, например, MitoQ10 – это хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце (рис.32). Эксперименты в данном направлении на изолированных митохондриях и клетках показали, что MitoQ10 эффективно накапливается в митохондриях, включаясь во внутреннюю митохондриальную мембрану со стороны матрикса. Изопреноидный хвост CoQ располагается в центре бислоя параллельно поверхности, заякоривая молекулу внутри мембраны; бензохиноновое кольцо CoQ также погружено в мембрану, но способно менять свою пространственную ориентацию, тем самым, обеспечивая перенос электронов. Молекула же MitoQ ориентирована иначе: бензохиноновое кольцо локализуется в толще бислоя, изопреноидный хвост перпендикулярен поверхности мембраны, а объемный катион ТРР находится на поверхности мембраны, обращенной в матрикс (рис. 35). Для гомологов CoQ c достаточно длинной боковой цепью молекулярная динамика и минимизация энергии показали свернутую структуру молекулы: последняя изопреноидная единица находится в тесном контакте с бензохиноновым кольцом.
Рисунок 35: Ориентация CoQ и MitoQ оносительно мембранного бислоя.
Тем не менее, MitoQ10 может окисляться и восстанавливаться митохондриальной дыхательной цепью и это в основном происходит в активных центрах дыхательных комплексов, а не за счет эндогенного пула убихинонов [74]. Было показано, что MitoQ10 может принимать электроны вблизи комплексов I и II и передавать их на комплекс III, возможно, конкурируя при этом с CoQ, а также эффективно блокирует окислительные повреждения [75].
Таким образом возможно осуществлять и направленный транспорт CoQ в составе MitoQ10, который способен выполнять функции антиоксиданта, а также блокировать многие из предполагаемых путей митохондриальной редокс-сигнализации и регуляции метаболизма, в том числе повреждение теломер, активацию UCP и пути, включающие в себя р53 [73].
Mito Vit Q – это аналог кофемента Q, являющийся производным α-токоферола (рис.32). Поскольку и CoQ и витамин Е проявляют антиоксидоньные свойства и предотвращают перекисное окисление липидов, то был синтезирован аналог убихинона Mito Vit Q. in vitro показано, что Mito Vit Q быстро и избирательно аккумулируются в изолированных митохондриях и в митохондриях изолированных клеток.
Помимо окислительных повреждений, АФК могут выполнять еще и сигнальную функцию, механизм которой пока еще малоизучен. Адресованные антиоксиданты могут так же использоваться для выслеживания сигнальных путей. Так с помощью Mito PBN (spin trap) (рис. 32) показали, что супероксид индуцирует активацию разъединения белков через образование из карбонильных радикалов фосфолипидов [73]. Mito PBN также модулирует роль продукции АФК в предполагаемых сигнальных путях внутри клетки.
Таким образом, катионы ТРР (трифенилфосфония), связанные с антиоксидантами и другими зондами, избирательно направляют их (связанные с ТРР молекулы) в митохондрии внутри клеток и in vivo. Это использует для изучения окислительного повреждения и, возможно, лечения вызываемых АФК заболеваний.