Гематологическая характеристика линя из узв и окуня оз. Виштынецкого (стр. 8 из 14)
У рыб значительная часть тромбоцитов депонируется в селезенке [21].
Среди исследователей крови существует единая точка зрения относительно функциональной значимости тромбоцитов. Эти клетки участвуют в процессе свертывания крови рыбы.
У рыб время свертывания - довольно не стабильный показатель, который зависит не только от способа взятия крови, но и факторов внешней среды, физиологического состояния рыбы.
Стресс-факторы повышают скорость свертывания крови у рыб, что свидетельствует о значительном влиянии центральной нервной системы на этот процесс.
В литературе описаны и межвидовые различия свертывания крови у рыб. Однако к этим данным стоит относиться с определенным скептицизмом, помня о том, что отловленная рыба - это рыба, подвергнутая резкому стрессу. Поэтому межвидовые различия, описанные в специальной литературе, вполне могут оказаться результатом различной устойчивости рыб к стрессам.
Таким образом, организм рыб надежно защищен от больших кровопотерь. Зависимость времени свертывания крови рыб от состояния нервной системы является дополнительным защитным фактором, поскольку крупные кровопотери возможны, скорее всего, в стрессовых ситуациях (нападение хищника, драки) [3, 13].
Объектами исследования были линь (Tinca tinca L.) и окунь (PercafluviatilisL.), а также их кровь, взятая у живых рыб. Сбор материала для определения гематологических показателей рыб проводился в 2007 - 2008 гг. в аквариальной кафедры «Аквакультуры» ФГОУ ВПО «КГТУ» и на оз. Виштынецком. Производители линя были отловлены в р. Неманин ставными сетями и 06.06.07 перевезены в аквариальную кафедры «Аквакультуры» ФГОУ ВПО «КГТУ», где осуществлялось их выращивание в экспериментальной УЗВ. Аквариальная предназначена для выращивания рыб и ведения научной деятельности. Она включает в себя два помещения: вентиляторная и основное помещение. В вентиляторной находится лабораторное оборудование: весы, ФЭК, различная лабораторная посуда, набор пипеток, реактивов, бинокуляр, стойка с аппаратами Вейса. Здесь осуществляется также хранение кормов. В основном помещении располагаются два стационарных бассейна, один из которых отстойник, два бассейна шведского типа, три пластиковых бассейна (объемом 300 л), спаренные аквариумы, аквариум для разведения живых кормов. Для подачи воздуха в выростные емкости используется компрессор. Также имеется набор переносных компрессоров. Для очистки воды используются биофильтры. Схема УЗВ представлена на рисунке 1.
1 - рыбоводные емкости; 2-биореактор; 3-U-образные уровневые трубки; 4-эрлифт; 5-биофильтр
Рисунок 1 – Схема УЗВ в аквариальной кафедры «Аквакультуры» ФГОУ ВПО «КГТУ»
Содержание производителей осуществлялось раздельно по полу в бассейнах. Биофильтр содержал четыре модуля биологической очистки, вода в которые подавалась при помощи помп. В качестве механических фильтров использовались снабженные губками помпы. Емкости для содержания рыбы были частично закрыты крышками, чтобы обеспечить необходимую для рыбы затененность и предотвратить выпрыгивание рыбы.
Регулярно проводилась очистка биофильтров и губок механических фильтров, чистка и частичная замена воды в выростных емкостях.
Кормили производителей кормом AllerAqua два-три раза в день. Ежедневно измеряли температуру воздуха в рабочем помещении, а также температуру воды в выростных емкостях.
Лини на протяжении большей части эксперимента содержались при температуре 24-26ºС, что соответствует оптимальной температуре для роста, созревания и нереста этого вида. В период с 10.10.07 по 13.03.08 с целью имитации зимовкисодержание производителей и ремонта линя осуществлялось при пониженных температурах (минимальная температура за этот период – 9,5ºС у ремонтного и 10ºС у маточного поголовья линя). На рисунке 2 изображен совмещенный график колебаний температуры воды и концентрации кислорода в УЗВ в период выращивания и содержания производителей линя.
Рисунок 2 – Динамика температуры воды и концентрации кислорода в бассейнах с производителями
Концентрация кислорода в экспериментальной УЗВ с производителями линя не опускалась ниже 5,56 мг/л, что соответствует благоприятным для линя значениям.
В УЗВ с двухгодовалыми особями линя, концентрация кислорода за период проведения эксперимента не опускалась ниже 6,27 мг/л, что соответствует благоприятным для рыб условиям.
В озере Виштынецкое сбор материала проводился 19-20 мая 2008 г.Окунь для исследований был выловлен ставными сетями на двух станциях, соответственно в 38 и 11 квадратах (рисунок 3), координаты которых указаны в таблице 2.
Таблица 2 – Координаты станций расположения ставных сетей в оз. Виштынецком
| Номер станции | Начало сети | Конец сети | ||
| широта | долгота | широта | долгота | |
| 1 | 54:25:43,4 | 22:43:09,1 | 54:25:30,3 | 22:43:22,4 |
| 2 | 54:26:55,8 | 22:42:23,2 | 54:26:46,5 | 22:42:13,3 |
Рис. 3 Расположение станций в оз. Виштынецкое
Во время отлова окуней температура воды в озере была 12°C, а содержание кислорода на ст. 1 – 11,32, на ст. 2 – 10,33 мг/л.
Всего была проанализирована кровь 5 экз. двухгодовалых линей и 9 экз. производителей линя в возрасте 4 года, 7 экз. окуня с первой станции в Виштынецком озере и 8 экз. – со второй станции.
Для сбора крови рыбу заворачивали в чистую марлю и с помощью скальпеля убирали слизь и чешую в месте взятия крови. Затем это место протирали ватным тампоном, смоченным 96% спиртом, и тщательно просушивали ватой. Иглой шприца делали прокол кожи по медиальной линии позади анального плавника и под углом 45° вводили иглу до позвоночника, где проходит ствол хвостовой артерии, иглой прорезали артерию и в шприц начинала поступать кровь
В качестве антикоагулянта применяли гепарин, которым предварительно ополаскивали шприцы, затем их высушивали [55].
Кровь для исследований брали в следующей последовательности:
1) перенесли кровь на часовое стекло;
2) приготовили мазок;
3) перенесли кровь в пробирки с консервирующим раствором;
4) перенесли кровь в трансформирующий раствор;
5) подсчитывали эритроциты в камере Горяева;
6) определяли гемоглобин на спектрофотометре;
7) фиксировали и окрашивали мазки крови;
8) определяли гемоглобин на спектрофотометре;
9) подсчитывали косвенным методом количество лейкоцитов;
10) определяли лейкоцитарную формулу [57].
Мазки приготавливали следующим образом: держа предметное стекло за узкие края переносили на него каплю крови. Другой рукой приставляли шлифовальное стекло узким краем к стеклу с кровью справа от капли под углом 45° и продвигали его влево до соприкосновения с кровью. Выжидали пока кровь расплывется по всему ребру шлифовального стекла и затем легким быстрым движением вели его слева направо до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. После приготовлений мазки сушили на воздухе до исчезновения влажного блеска [57].
Фиксировали и окрашивали мазки способом окраски по Паппенгейму. Предметные стекла ставили в киевский аппарат для массовой окраски мазков и заливали красителем-фиксатором Мая-Грюнвальда. Через 3 мин его заменяли рабочим красителем Романовского. Продолжали окрашивание в течение 15 мин, после чего краситель сливали, а мазки промывали водопроводной водой. Потом стекла ставили под углом для высушивания [57].
Определяли следующие показатели крови: концентрацию гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, общего белка в сыворотке крови, лейкоцитарную формулу, цитометрические характеристики эритроцитов.
Подсчет эритроцитов и лейкоцитов проводился с помощью камеры Горяева. Эритроциты считали в 5 больших квадратах камеры, а лейкоциты будут подсчитаны косвенным методом. Определяемую величину получали по формуле (1).
Х =
, (1)где Х- число клеток в 1 мкл крови; а – количество подсчитанных клеток; y – степень разведения крови; n – количество малых квадратов.
для эритроцитов:
Хэ =
= а*12500;для лейкоцитов:
Хл =
= а*2500 [53].Для определения гемоглобина использовали гемиглобинцианидный метод на ФЭК с использованием ацетонциангидрина. Расчет содержания гемоглобина будет проводиться по формуле (2):
Hb, г/л =
, (2)где Еоп – экстинция опытной пробы; Ест – экстинция стандартного раствора; С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе (59,75 мг%); К – коэффициент разведения крови; 0,01 – коэффициент для пресчета концентрации гемоглобина из мг в г*л -1 [53].
Концентрацию белка крови рыб определяют с помощью коэффициента преломления сыворотки на рефрактометре. Коэффициент преломления довольно точно свидетельствует о количественном содержании в сыворотке белка, которое определяется по таблице [53].
Концентрацию общего белка в сыворотке крови (в г*л -1) определяют по графику, используя найденный коэффициент преломления [53].
Подсчет лейкоцитарной формулы крови на окрашенных препаратах проводили с использованием светового микроскопа с применением иммерсии (увеличение 90х15, 100х15). На мазках подсчитывали 200 лейкоцитов по общепринятой методике. При идентификации лейкоцитов использовали классификацию клеток крови рыб Н.Т. Ивановой (1983). Подсчет лейкоцитарной формулы проводился по следующим группам лейкоцитов: нейтрофилы, среди которых выделяли: миелоциты нейтрофильные, метамиелоциты нейтрофильные, палочкоядерные нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы; псевдоэозинофилы, эозинофилы, псевдобазофилы, моноциты; малые и большие лимфоциты.