Как видно из данных табл. 6–8, максимальные удельная скорость размножения и время регенерации характерны для состава, содержащего Wetter HAC (культура типа 3), и составляет 0,1341 и 4,65 соответственно при 24 ч культивирования. В основном, после 48 ч культивирования наблюдается снижение данных показателей до отрицательной величины. Это указывает на то, что оптимальным временем культивирования является 48–72 ч. Практически во всех случаях наблюдается увеличение показателей активной реакции среды и кислотности. Увеличение рН, вероятно, связано с тем, что для синтеза аминокислот, которые являются составляющими ферментов, необходим азот. Свободный азот микроорганизмы способны фиксировать из воздуха и прежде, чем такой окисленный элемент станет составной частью аминокислот, он должен быть восстановлен. Восстановление азота до аммиака происходит с участием АТФ, кроме того, в состав сред входит NH4Cl, который также участвует в образовании аминокислот, и образующийся аммиак различными путями включается в состав органических соединений и прежде всего в состав аминокислот. И на этом этапе образования аммиака и происходит увеличение рН.
Для таких СПАВ, как Гамма (культура Listeria sp 7) и De-sol-A (культуры типа 7 и I') после 72 ч культивирования наблюдается незначительное понижение рН с 5 до 4,95, с 4,5 до 4,4 и с 4,45 до 4,4 соответственно. Это, вероятно, связано с тем, что протекала деструкция жировых веществ до глицерина и жирных кислот, которые и способствовали созданию кислой среды. Химизм этого процесса можно представить следующим образом:
О
//
СН2-С
\
R
О СН2-ОН
// 3 ОН – ½
CН-С –® СН-ОН + RCOO-
\ ½
R СН2-ОН
O
//
CH2-C
\
R
Источником углерода в синтетических средах для культур рода Listeria sp являлись СПАВ различной химической природы. Использование данных ингредиентов в качестве питательного субстрата подтверждалось уменьшением концентрации СПАВ в процессе культивирования.
На основании данных, представленных в табл. 6–8 можно сделать вывод о том, что концентрация исследуемых СПАВ уменьшается. Максимальная степень деструкции была характерна для сред, содержащих Превоцелл W-OF-7. Концентрация за 96 ч уменьшилась с 0,47 до 0,09 г./дм3 – для культуры Listeria sp 3, то есть на 81%, с 0,48 до 0,06 г./дм3 (культура типа 7) – на 88%, с 0,46 до 0,06 г./дм3 (культура типа I') – на 87%. Минимальная степень деструкции наблюдалась для составов, содержащих Гамма и De-sol-A и составила 31,3 и 65,3% соответственно. Вероятно, такое небольшое уменьшение концентрации СПАВ связано не только с вовлечением их в клеточных метаболизм, но и с частичной их адсорбцией на поверхности стенок сосудов и клеток микроорганизмов.
Интенсивное вовлечение неионогенного СПАВ Превоцелл W-OF-7 в метаболические процессы, возможно, связано с тем, что он имеет как гидрофобную, так и гидрофильную группу из органических веществ, что определяет принципиальную возможность окисления с обоих концов молекулы. Биохимический распад НПАВ происходит путем карбоксилирования конечной метильной группы алкильной цепи с последующим ее окислением и гидролизом полиэтиленгликолевой цепи.
Для подтверждения полученных данных был проведен качественный анализ деструкции СПАВ с использованием спектрофотометра ИКС-29 производственного объединения ЛОМО. Для этого из приготовленной пробы готовили суспензию в виде пасты с несколькими каплями вазелинового масла, количественно переносили в нижнюю крышку кюветы и устанавливали в канале спектрофотометра.
На спектрограммах, представленных на рис. для Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма, De-sol-A в области валентных высоких колебаний средней интенсивности появлялись полосы поглощения в диапазоне 2940–2910 см-1, 3000–2850 см-1, которые можно отнести к валентным колебаниям алкильной части молекулы, что по литературным данным составляет 3350–3200 см-1. Полосы поглощения 1650–1300 см-1 можно охарактеризовать наличием оксиэтильной части молекул, что по литературным данным соответствует 1460–1000 см-1.
Как видно из рис. и рис. (приложение 2) для всех СПАВ, за исключением Превоцелла W-OF-7 (культура рода Listeria sp I' и 7) и Гаммы (Listeria sp I') через 48 ч культивирования наблюдается увеличение пиков, а затем к 96 ч – сглаживание пиков. Это объясняется, вероятно, тем, что на начальном этапе в результате деструкции образуются какие-либо вещества, затем СПАВ начинают вовлекаться в конструктивно-энергетический обмен. Наиболее полно утилизировался СПАВ De-sol-A культурой рода Listeria sp 7, его молекула подвергалась деградации сразу с 2-х сторон – с оксиэтильной цепи и углеводородного радикала. Для СПАВ, которые являлись исключением наблюдается увеличение пиков на протяжении 96 ч.
Как видно из данных табл. 6–8, на протяжении всего периода культивирования наблюдается увеличение протеолитической активности, которая указывает на разрушение белка. Так, минимальная величина протеолитической активности после 96 ч культивирования была характерна для составов с Wetter HAC (культура типа 7) и Гамма (культура типа I') и составила по 12,88 ед/г каждая. Постепенно микроорганизмы начинали вовлекать в конструктивно-энергетический обмен и шерстный жир, который входил в состав жидких синтетических сред, поэтому ферментный препарат обладал и липолитической активностью. Так, максимальное значение данной величины наблюдалось для сред, содержащих в своем составе Wetter HAC (культура рода Listeria sp 7) – 85,71 ед/г, Гамма (культура типа 3) – 76,0 ед/г и 57,14 ед/г – для Превоцелл W-OF-7 (культура типа I'). Повышение липолитической активности наблюдалось на конечной стадии развития прокариотических организмов, так как в это время жировые вещества наиболее полно вовлекаются в метаболические процессы. Преобладание липолитической активности над протеолитической составило 3–4 раза.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что максимальная степень деструкции характерна для СПАВ типа Превоцелл W-OF-7 (85,3%), Wetter HAC (79,3%). Максимальная липолитическая и минимальная протеолитическая активности наблюдались у экзофермента, продуцированного на среде, содержащей СПАВ Гамма (культура типа 3) – 76,0 ед/г и 13,72 ед/г соответственно, у белка, продуцированного Wetter HAC (культура типа 7) – 85,71 и 12,88 ед/г, а также у белка, продуцированного Превоцелл W-OF-7 (культура типа I') – 57,14 и 13,16 ед/г. У выше перечисленных СПАВ наблюдается и максимальная концентрация белка. Следовательно, у ферментных препаратов, продуцируемых на синтетических средах культурами рода Listeria sp 3,7, I', содержащих такие СПАВ, как Гамма, Wetter HAC и Превоцелл W-OF-7. Данные СПАВы наиболее полно вовлекались в конструктивно-энергетический обмен и были использованы для дальнейших исследований при разных значених активной реакции среды.
Для дальнейшего эксперимента готовили среды, содержащие в качестве источника углерода Превоцелл W-OF-7, Wetter HAC, Гамма и создавали различные рН (кислая, нейтральная и щелочная). В среду с Превоцелл W-OF-7 вводили со скошенного агара культуру рода Listeria sp I', c Wetter HAC – культуру типа 7 и с Гамма – культуру типа 3. Культивирование проводили при температуре (38±0,5)0С при переменном механическом воздействии на «Shaker Type» с частотой колебания 250 об/мин и амплитудой 6 в течении 72 ч. Через каждые 24 ч снимали следующие показатели: КОЕ, рН, кислотность, мутность, концентрацию белка (г/дм3), а также липолитическую и протеолитическую активности. Данные определений представлены в табл. 9.
Как видно из табл. 9, величина КОЕ во всех случаях увеличивается. На это указывает увеличение мутности в кислой и нейтральной средах. В щелочной среде роста для всех СПАВ и культур не налюдается, но о развитии микроорганизмов говорит резкое повышение мутности после 48 ч культивирования в 2–3 раза и увеличение концентрации белка с 0,36 до 1,57 г./дм3 – для Превоцелл W-OF-7, с 0,18 до 0,55 г./дм3 – для Wetter HAC и с 0,22 до 0,53 г./дм3 – для Гамма. Максимальная концентрация белка наблюдается при рН=7,35 у cреды, содержащей в качестве источника углерода Превоцелл W-OF-7 (2,85 г./дм3) и при рН=4,85 у cреды с Wetter HAC (2,69 г./дм3).
В кислой и щелочной средах, частично в кислой, средах наблюдается уменьшение величины активной реакции среды, что связано с деструкцией жировых веществ с образованием жирных кислот.
Минимальное значение протеолитической активности характерно для среды, содержащей в своем составе Wetter HAC при рН=4,85 (7,96 ед/г) и Превоцелл W-OF-7 при рН=7,35 (7,13 ед/г) после 72 ч культивирования. В щелочной среде данный показатель во всех случаях был практически одинаковый. Максимальной липолитической активностью (деструкцией жировых веществ) обладали те же СПАВ: Wetter HAC (рН=4,85), Превоцелл W-OF-7 (рН=7,35 и рН=8,55) и ее значение составило 85,50; 89,47; 72,55 ед/г соответственно.
Таким образом, синтетическую среду, содержащую ферментный препарат, продуцируемый культурой рода Listeria sp I', и Превоцелл W-OF-7 при всех значениях активной реакции среды (рН<7, рН~7, рН>7), а также Wetter HAC и ферментный препарат, продуцируемый культурой рода Listeria sp 7 при рН<7, могут быть использованы для дальнейшего проведения процесса обезжиривания.
3.3 Изучение возможности проведения процесса обезжиривания I с применением ферментного препарата
Целью данного этапа эксперимента было получение ферментных препаратов на средах, содержащих в качестве источника углерода СПАВ (Превоцелл W-OF-7 с рН<7, рН~7, рН>7 и Wetter HAC с рН<7) и шерстный жир, с последующим их применением для проведения процесса обезжиривания I меховой овчины.
В результате выполненных ранее экспериментов были разработаны оптимальные условия культивирования культур рода Listeria sp I' и 7 c целью получения комплексного ферментного препарата с заданными свойствами. Состав синтетических сред представлен в табл. 10.
Таблица 10. Состав синтетических сред
| Расход химматериалов, г/дм3 | ||
| Компоненты | среда, содержащая | |
| Превоцелл W-OF-7 | Wetter HAC | |
| NaH2PO4 | 1,0 | 1,0 |
| NH4NO3 | 1,0 | 1,0 |
| KCl | 0,5 | 0,5 |
| MgCl2 | 0,1 | 0,1 |
| Превоцелл W-OF-7 | 0,5 | - |
| Wetter HAC | - | 0,5 |
| Шерстный жир | 1,0 | 1,0 |
Среды культивировали в течение 72 ч при температуре (38±0,5)0С при переменном механическом воздействии на «Shaker Type» с частотой колебаний 250 об/мин и амплитуде 6.