Таким образом, ПАВ выступают в качестве своеобразных регуляторов микробного обмена веществ и могут оказывать влияние на рост и развитие некоторых микроорганизмов, включая дрожжи, растущие на отходах нефтепроизводства, а также пропионовокислых бактерий – синтетиков витамина В12. Эти особенности ПАВ требуют дальнейшего изучения, что позволит в будущем использовать их в биотехнологических производствах.
ПАВ способны вызывать дезинтеграцию клеточных структур микроорганизмов и активно влиять на реакцию обмена веществ. Это свойство детергентов широко используется для лизиса микроорганизмов и имеет большое практическое значение, особенно при патогенных формах. При исследовании влияния длины углеводородной цепи ПАВ неароматических четвертичных аммониевых солей и неионных оксидов аминов на их ККМ и антимикробную активность установлено, что с ростом этой длины минимальная ингибирующая концентрация увеличивается, а значение ККМ уменьшается. Так, наибольшей антимикробной активностью обладают ПАВ при ККМ ниже 100 мгк/мл /19/.
В результате изучения генетики гибели и ультраструктуры грамположительных и грамотрицательных бактерий после воздействия алкилдиметиламмонияхлорида установлено, что низкие концентрации (0,0001%-е) оказывают выраженный бактерицидный эффект, который выше по отношению к грамположительным бактериям. Определяющим в механизме действия КПАВ является нарушение целостности цитоплазматической мембраны. В цитоплазме погибших бактерий выявлены мембранные структуры различной конфигурации и локализации, не связанные с делением клетки и явяляющиеся, по-видимому, результатом самосборки распавшихся под воздействием детергента липидных компонентов мембран. Выращиванию культуры на среде с диталаном приводит к нарушению процесса спорообразования. Показано, что клетки, находящиеся в состоянии покоя, проявляют большую устойчивость к высоким дозам детергента. Противомикробная активность КПАВ может увеличиваться при включении в их молекулы остатков пропионовой и уксусной кислот /9/.
Установлено /4/, что анионные и неионные детергенты, содержание которых не превышает 0,001–0,4%, не влияют на рост дрожжей. Однако при больших концентрациях эти ПАВ оказывают заметное фунгицидное и фунгистатическое действие. Различное влияние оказывают ПАВ при их совместном использовании с антибиотиками и другими лекарственными препаратами. Так, наблюдался эффект усиления действия тетрациклинов в отношении устойчивости грамотрицательных микроорганизмов с помощью катамина АБ, что объясняется повышенным накоплением антибиотика клетками при обработке их ПАВ. В то же время установлено, что снижение в присутствии НПАВ антибактериальной активности поливинилпироллидониода, бензолкониумхлорида и гексахлорфенола в отношении стафилококков и псевдомонад. ПАВ нашли применение и в некоторых вирусологических исследованиях. При изучении влияния различных концентраций щелочного раствора твина 20 (0,2%-го) на физические и биологические свойства вируса Сендай установлена потеря гемолитической активности и заметное уменьшение его инфекционности. В зависимости от концентрации детергента фрагментаы оболочки вируса различались чувствительностью к эритроцитам, биологической актиновностью и физическими свойствами. НПАВ оказались активными также по отношению к вирусу герпеса. Несомненно, что быстрейшее выяснение механизма действия ПАВ позволит с большим успехом применять детергенты как антимикробные средства /21/.
При изучении чувствительности микроорганизмов ПАВ установлена следующая особенность: если питательную среду, содержащую 0,05% додецилбензолсульфоната (сульфонола), подвергнуть кипячению, то в ней погибают все микроорганизмы. После посева в ней могут расти только грамотрицательные бактерии. Это свойство сульфонола использовано для стерилизации питательных сред, предназначенных для грамотрицательных микроорганизмов. Клетки бактерий, растущие при 0,05%-й концентрации детергента, а также более высокой, являлись грамотрицательными. Пороговой концентрацией в питательной среде, при которой могли расти грамположительные бактерии, была 0,008-я и более низкая. Деление бактерий по чувствительности к додецилбензолсульфонату может служить одним из признаков, на основании которых производится классификация микроорганизмов /22/.
1.2 Щелочные протеиназы рода Bacillus
Внеклеточные щелочные протеиназы выполняют ряд важных катаболических функций вне клетки. Наиболее очевидной функцией щелочных протеиназ является расщепление белков и других высокомолекулярных субстратов, содержащихся в питательной среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь микробной клетки. Щелочные протеиназы играют определенную роль в других жизненно важных процессах клетки. Предполагается, что сериновая протеиназа выполняет три внутриклеточные функции: 1) участвует в синтезе белковой оболочки, вероятно, снабжает аминокислотами, 2) играет роль мусорщика – убирает ненужные вещества клетки, 3) принимает участие в модификации ферментов, особенно РНК-полимеразы /23/.
В 1938 г. Кунитц впервые высказал предположение о существовании связи между процессом спорообразования и активностью щелочной протеиназы. Внеклеточные щелочные протеиназы бактериального происхождения, главным образом из Bacillus subtilis, изучены более детально. Это – ферменты широкой специфичности, гидролизуют до 80 связей в белках, с оптимумом рН в щелочной зоне. Впервые фермент был выделен, очищен и охарактеризован в лаборатории Карлсберга (Копенгаген). Фермент был назван субтилопептидазой А, алкалазой, субтилизином А, а затем за ним закрепилось название субтилизин Карлсберг. Позднее, в той же лаборатории из другого штамма Bac. subtilis был получен другой фермент. Этот фермент получил название субтилизина Novo. Несмотря на большое сходство с субтилизином Карлсберг, он все же не был идентичен ему, отличаясь некоторыми физико-химическими и энзиматическими свойствами. Одновременно с этими исследованиями в Японии была выделена протеиназа, продуцируемая культурой Bac.amyloliquefaciens. Она получила название BPN’. Таким образом, в настоящее время изучено три щелочные протеиназы типа субтилизина. Они имеют много общих свойств, но тем не менее субтилизин Карлсберг отличается от субтилизинов Novo и BPN’, являющихся идентичными. Молекулярный вес субтилизинов 27 000. При рН 5,0 и ниже фермент быстро и необратимо инактивируется. Оптимум рН действия для всех субтилизинов лежит в области рН 9–10. Ферменты проявляют широкую специфичность при гидролизе белков. Обладают эстеразной активностью /24/.
Несмотря на значительное сходство: 1) в ферментативном поведении, 2) гидролизе одних и тех же субстратов, 3) сходной реакции по отношению к одним и тем же ингибиторам, 4) близости происхождения, субтилизины отличаются между собой. Изоэлектрическая точка субтилизина Карлсберг лежит в зоне рН 9,4, субтилизина Novo и BPN’ – 7,8. Субтилизин состоит из одной пептидной цепи и 275 аминокислотных остатков. Субтилизины – одни из немногих белков, для которых определна трехмерная структура и построена модель молекулы.
По механизму действия и субстратной специфичности субтилизины близки к сериновым протеиназам животного происхождения – химотрипсину, трипсину, несмотря на отсутствие какого бы то ни было сходства в структуре между ними /25/.
Характер регуляции биосинтеза щелочных протеиназ изучен недостаточно. Щелочным протеиназам принадлежит ряд важных функций в процессах клеточной дифференцировки, в частности спорообразования. Известно, что щелочные протеиназы различных типов образуются в основном спорообразующими видами бактерий, причем образование фермента тесно связано с процессом спорообразования /26/.
Спорообразующие виды бактерий являются продуцентами многих биологически активных соединений. Образование ряда антибиотиков, ферментов и токсинов начинается после завершения активного роста продуцентов и совпадает с началом их споруляции. Поэтому выяснение связи процесса споруляции с образованием различных биологически активных соединений и изучение функций этих соединений представляет важность для разработки как общих принципов, так и частных методов селекции высокопродуктивных штаммов спорообразующих микроорганизмов. Следует отметить, что большинство продуцентов, характеризующихся сверхсинтезом фермента, в генетической плане практически не изучены /27/.
Исследования подобного рода представляют также определенный интерес и в связи с изучением механизма дифференцировки спор, поскольку ряд биологически активных соединений, накапливающихся при споруляции, по-видимому, участвует в регуляции различных этапов этого процесса.
1.2.1 Генетика и физиология спорообразования различных видов рода Bacillus
Жизненный цикл спорообразующих бактерий состоит из прорастания споры, вегетативной стадии, перехода к споруляции и завершается образованием зрелой споры. Причем изменения структуры клетки при переходе в споруляционное состояние осуществляются во времени и составляют несколько этапов.