На модели Bac. subtilus установлена последовательность из семи этапов споруляции /28/, характеризующихся определенными морфологическими изменениями. Выяснению последовательности этапов спорообразования во много способствовало также выделение мутантов, неспособных образовывать зрелые споры – «spo» – мутанты. В зависимости от нарушения определенного этапа спорообразования данные мутанты классифицируют как spo0, spoI, spoII и та далее.
Генетическое нарушение определенного этапа спорообразования характеризуется отсутствием ряда морфологических и биохимических функций, т.е. определенными фенотипическими последствиями. Например, характерной чертой spo0-мутантов, имеющих нарушение «0» стадии споруляции, является плейотропность, т.е. наряду с нарушением способности клеток спорулировать не осуществляется ряд биохимических событий, таких, как образование протеиназ, пептидных антибиотиков, сохраняется чувствительность к некоторым фагам и исчезает компетентность при трансформации.
Более детальный анализ показал, что как переход от вегетативной стадии роста к спорообразованию, так и переключение с одного этапа спорообразования на другой коррелирует с рядом биохимических изменений в клетке, в частности со снижением синтеза общей РНК, модификацией синтеза ДНК, а также с появлением определенных биологически активных соединений. Результаты генетических исследований различных классов мутантов показали, что процесс спорообразования определяется полигенной системой, локализующейся в различных районах хромосомы Bac. subtilus (более 100 генов). В настоящее время на хромосоме Bac. subtilus локализовано 28 оперонов, отвечающих за VII этапов процесса спорообразования /29/.
Считается, что регуляция спорообразования может осуществляться на нескольких уровнях: на уровне транскрипции, трансляции и посттрансляционной регуляции.
Регуляция спорообразования на уровне транскрипции. Результаты исследования перехода клеток Bac. Subtilus от вегетативной стадии к спорообразованию показали, что этот процесс во многом определяется изменением матричной активности РНК-полимеразы вегетативных клеток на раннем этапе споруляции. Показано, что во время вегетативного роста 85% иРНК транскрибируется с тяжелой нити ДНК и лишь 15% – с легкой нити. Популяция иРНК спорулирующих летокпредставлена иРНК, транскрибирующейся как с легкой, так и с тяжелой нити ДНК, причем с преимущественным синтезом иРНК на матрице легкой нити ДНК. На основании этих данных было сделано предположение, что споруляционные гены имеют специфичные промоторные участки на легкой нити ДНК /30/.
Показано, что бактериофаг b3 может инфицировать и реплицироваться в клетках Bac. subtilus, находящихся в логарифмической фазе роста, но не в спорулирующих клетках. В дальнейшем было обнаружено, что только РНК-полимеразы из клеток в логарифмической фазе обладает матричной специфичностью в отношении ДНКфага, тогда как РНК-полимераза спорулирующих клеток неспособна использовать ДНК данного фага как матрицу, но обладает повышенной активностью на синтетической матрице поли-dАТ. Вместе с тем подобного изменения матричной активности у мутантов с нарушенным спорообразованием в стационарной фазе роста не происходило. В связи с этим считают, что при переходе от вегетативного роста к спорообразованию происходит модификация специфичности РНК-полимеразы, следствием чего является прекращение считывания вегетативных членов и «включение» экспрессии споровых генов /31/.
Первоначально считали, что изменение специфичности РНК-полимеразы связано с модификацией b-субъединицы фермента, причем появление модифицированной субъединицы происходит за счет ее протеолитического расщепления щелочной протеиназы. Эти выводы были сделаны на основании того, что РНК-полимераза, выделенная из вегетативных и спорулирующих клеток, имела b-субъединицы с разным молекулярным весом. Таким образом, изменение матричной специфичности РНК-полимеразы не связано с модификацией минимального фермента, а, по мнению некоторых авторов, связано с утратой или инактивацией s-фактора /32/.
Таким образом, природа изменений РНК-полимеразы при переходе от вегетативных клеток к споруляции и роль этих изменений в ее матричной активности для включения процесса спорообразования окончательно не установлены. Вместе с тем данное направление исследования во многом определит выяснение природы перехода клеток к споруляции.
Регуляция спорообразования на уровне трансляции. Известно, что процесс спорообразования начинает осуществляться в стационарной стадии развития Bacillius, на которой происходят многочисленные изменения в аппарате трансляции клетки. В связи с этим определение изменений в данном аппарате, которые связаны именно со споруляционным процессом, затруднено. Это объясняется следующими причинами. Для обнаружения изменений в аппарате трансляции необходимо выделение, изучение и сравнение внутриклеточных компонентов, участвующих в трансляции, из вегетативно растущих клеток, клеток в стационарной фазе и спор. Однако в связи с тем, что количество нуклеаз и протеинах к моменту начала процесса спорообразования значительно возрастает, компоненты трансляционного аппарата претерпевают неспецифические модификации в момент своего выделения /33/.
До настоящего времени окончательно не установлено существование стабильных иРНК, специфичных для спорообразования. Однако имеются данные, указывающие на наличие стабильных споруляционных иРНК. Добавление меченого актиномицина D к культуре Bac. subtilus через определенные промежутки времени от начала процесса спорообразования позволило обнаружить различные классы спороспецифичных иРНК /32/.
Результаты изучения ДНК-РНК-гибридизации также указали на существование стабильной фракции иРНК в прикрепленных к мембране полирибосомах спорулирующих клеток, обработанных актиномицином D. Рядом исследователей показано, что при переходе к споруляции рибосомы вегетативных клеток претерпевают изменения. В результате использования белок-синтезирующей системы in vitro обнаружено, что у Bac. subtilus рибосомы становятся неспособными транслировать вегетативные иРНК при переходе клеток к споруляции. Таким образом, на основании данных, указывающих на наличие стабильной фракции иРНК, изменений в структуре рибосом, конформационных изменений в клеточной мембране, можно предполагать возможность функциональных изменений механизма, который определяет специфичную для процесса спорообразования трансляцию /31/.
Посттрансляционная регуляция спорообразования. Регуляция спорообразования на посттрансляционном уровне в настоящее время изучена недостаточно, однако считается, что этот вид регуляции, связанный с модификацией белков клетки, является необходимым для завершения споруляционного процесса. Обнаружен специфичный состав белков для каждой стадии спорообразования. Считается, модификация РНК-полимеразы, субъединиц рибосом и мембранных компонентов клетки происходит в результате посттрансляционных изменений и связана с фосфорилированием, аденилированием уже существующих белков, а также с образованием пептидных антибиотиков /27/.
Роль щелочной протеиназы в процессе спорообразования. В процессе споруляции Bac. subtilus образуются тир протеолитических активных фермента: сериновая протеиназа (субтилизин), работающая при щелочных значениях рН, в связи с чем в литературе обычно приводится название щелочная протеиназа; металлсодержащая протеиназа (нейтральная), рН оптимум которой находится в нейтральной зоне рН, и эстераза – фермент, обладающий невысокой протеолитической активностью. Различные представители рода Bacillus обладают специфической способностью к образованию определенного типа внеклеточной протеиназы. Так, Bac. megaterium и Bac. cereus синтезируют только нейтральную протеиназу, в то время как Bac. licheniformis, Bac. natto и Bac. subtilis образуют как нейтральную, так и щелочную протеиназы. Следует отметить, что Bac. subtilis по способности образования протеиназы различного типа можно подразделить на четыре группы; к первой относятся штаммы, синтезирующие только щелочную протеиназу, вторая группа образует только нейтральную протеиназу, представители третьей группы выделяют в среду как щелочную, так и нейтральную протеиназы, щелочная протеиназа у представителей четвертой группы появляется в среде только после того, как исчезнет нейтральная протеиназа /34/.
Установлено, что нейтральная протеиназа не участвует в процессе спорообразования, тогда как щелочная протеиназа необходима для включения данного процесса. В частности, выделен температурочувствительный по щелочной протеиназе мутант Bac. subtilis ts5. В условиях инкубации при 470С, т.е. температуре, при которой проявляется дефект температурочувствительного субтилизина, мутант не спорулировал. Восстановление активности щелочной протеиназы при 300 сопровождалось споруляцией вегетативно растущих клеток. Момент нарушения процесса спорообразования у данного ts5 мутанта совпадает с 0 стадией споруляции /35/.
В то же время описана большая группа плейотропно негативных мутантов, которые имели блок на 0 стадии спорообразования и характеризовались отсутствием способности к образованию щелочной протеиназы. Таким образом, из представленных данных можно судить о наличии корреляции между образованием щелочной протеиназы и спорообразованием. В последующих работах для определения участия протеиназ в процессе споруляции использовали два подхода. Первый подход состоял в создании условий, при которых ингибируется спорообразование. Обнаружено, что клетки, голодающие по тимидину, не спорулируют и не образуют такие экзоферменты, как протеиназы, рибонуклеазы, щелочную фосфатазу, при это не затрагивается только образование a-амилазы. На основании этих данных авторы предложили, что указанные ферменты прямо или косвенно связаны со спорообразованием /36/.
Вторым подходом для определения участия именно щелочной протеиназы в споруляционном процессе послужило использование специфичного ингибитора щелочной протеиназы – фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Добавляя ингибитор через различные промежутки времени от начала процесса образования спор, обнаружили, что в осуществлении данного процесса имеется чувствительный период, продолжающийся 2–3 часа. Добавление ингибитора в этот период приводит к нарушению спорообразования, при этом не образуется щелочная фосфатаза, рибонуклеаза и термоустойчивые споры. Уровень синтеза нейтральной протеиназы в отсутствие ингибитора постоянно возрастает к началу спорообразования, затем либо незначительно снижается, либо достигает плато. Добавление PMSF приводит к возрастанию уровня накопления нейтральной протеиназы, при этом спорообразование отсутствует. На основании этих данных авторы сделали вывод о том, что нейтральные протеиназы по мере своего накопления разрушаются щелочной протеиназой и не участвуют в спорообразовании /26/.