Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina (стр. 7 из 11)
в) Векторетная ПЦР
Cтратегия векторетного ПЦР заключается в создании адаптеров (двухцепочечных молекул ДНК) используя комплементарные олигонуклеотиды (вектореты), с последующим отжигом друг с другом. Отжиг комплементарных последовательностей vect57 и vect53 (табл. 5) проводили при температуре 65°С в течении 5 мин с последующим охлаждением во льду. Для стабилизизации полученного адаптера в реакционную смесь добавили MgCI2 до концентрации 25 мМ и инкубировали при 65°С в течении 5 мин, затем охлаждали в течении 1 ч при комнатной температуре.
Для векторетной ПЦР хромосомную ДНК (10 нг) инкубировали в присутствии 20 ед. рестриктазы BamHI при 37°С с последующей инактивацией рестриктазы при 65°С 20 мин. Лигирование разрезанной хромасомной ДНК и адаптеров проводили в присутствии 50 ед. T4 Ligase при 16°С 12-16 ч. Праймер C20 и специфичный для гена ask праймер AskF использовали в ПЦР для амплификации гена ask. Праймер C20 и специфичный для гена ectA праймер ectF использовали в ПЦР для амплификации гена ectA.
г) Амплификацию генов биосинтеза эктоина из хромосомной ДНК (10 нг) проводили с использованием прямого и обратного праймеров (15 пмоль каждого) (табл. 10). Для амплификации полного гена ectA из M. marina использовали праймеры EAN и EAС, для гена ectB - ectBN и ectBC, для гена ectС - ectСN и ectСC и для гена ask – AskN и PET19Z или AskN и BglII. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего гены ectАВС, использовали праймеры Opr1 и Opr2. Реакцию проводили, используя смесь ДНК-полимераз Tag/Pfu в соотношении активностей 20:1. Остальные компоненты реакции были те же, что и в стандартной ПЦР.
Коньюгация.
Для коньюгации использовали штамм-донор E. coli S17-λpir, который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pBSL-180:Pmax:ectABC (полученной на основе рBSL-180). 10 мл ночной культуры E. coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды “K”. Клетки ресуспендировали в 0.5 мл среды “K”. В качестве реципиента использовали штамм Methylobacterium extorquens AМ1. 50 мл культуры, выращенной до ОП600=0.4, центрифугировали и промывали средой “K”. Клетки метилобактерий ресуспендировали в 0.5 мл среды “K” и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток E. coli. Смесь переносили на агаризованную среду “К”, содержащую 0.2% Proteose peptone (“USBiological”, США), чашки инкубировали 24 ч при 28 °С. После инкубации клетки смывали с поверхности агара 2 мл стерильной среды “К”. Аликвоту суспензии 10-20 мкл растирали на селективной агаризованной среде “К”, содержащей 0.5% метанола и 30 мкг/мл канамицина. Чашки инкубировали до образования колоний (обычно 6 дней). Для удаления (присутствующих) клеток E. coli, трансконьюганты пересевали на агаризованную среду “К”, содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицина.
4.6 Определение и анализ последовательностей нуклеотидов
Cеквенирование ДНК проводилось на фирме “Силекс” (Москва) с помощью “Big Dye Terminator Ready Reaction Kit” (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом ДНК секвенаторе “DNA Sequencer ABI PRISM 310” (“Applied Biosystems”, США), в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Использовали 0.3-0.5 мкг ПЦР-фрагмента и соответствующий праймер. Для определения полной последовательности нуклеотидов в ДНК фрагментах, длина которых превышала 1000 п.н., на основе полученных последовательностей конструировали новые праймеры. Эти праймеры использовали затем для реакций секвенирования.
Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00, пакета программ VectorNTI®Advance v.9.0, DNAStar v.4.04 и Clone Manager 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (v1.62b) (Thompson et al., 1997) и GeneDoc. Филогенетический анализ осуществляли с помощью пакета программ PHYLIP v.3.6, используя программы SEQBOOT, PROTPARS и CONSENSE (Felsenstein, 2004).
4.7 Клонирование и экспрессия гена ectA
Ген ectA, содержащий сайт для рестриктазы Nco при инициирующем кодоне и сайт на 3’ конце фрагмента для HindIII, амплифицировали из геномной ДНК M. marina с использованием праймеров EctA(halN-N) и EctA(hal-C) (табл. 10). Фрагмент после обработки рестриктазами Nco и HindIII, содержащий ген ectA, лигировали в вектор pET28, с образованием вектора pETectA.
4.8 Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы
Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA, выращивали в 0.5 л среды LB c Аmp (50 мкг/мл для pETectA) при 37 ºС до оптической плотности А600 = 0.6-0.7, добавляли Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E. coli, как описано в протоколах фирмы “Quaigen” (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3×0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 °С, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni2+-нитроацетат агарозу (“Quiagen”), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом SDS электрофореза по Лэммли. Фракция, содержащая целевой белок (EctA-His6-tag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-НCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КCl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM-10 (“Millipore”, США).
Гель-фильтрацию белка EctAhal1-His6, проводили на колонке c Ultrоgel AcA54 (1.5×90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НСl, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Скорость элюции - 15 мл/ч. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (“Sigma” и “Pharmacia”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). Выход белка определяли по поглощению при 280 нм на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США).
4.9 Определение физико-химических свойств ферментов
Определение рН- и температурных оптимумов ДАБ-ацетилтрансферазы.
При определении рН-оптимумов применяли буферные системы рН 6.0-9.0. Использовали следующие буферные растворы: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0-8.0; 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. Температурные оптимумы определяли в интервале температур от 5 до 35 ºС с использованием термоконтроллера “Shimadzu UV-160” (Япония).
Таблица 3. Буферы и растворы, использованные в работе.
| Буферы/растворы | Применение | Состав | |
| Компоненты | Концентрация | ||
| TBE, 5× | Электрофорез ДНК в агарозном геле | Трис-HCl Борная кислота ЭДТА, рН 8.0 | 0.445 М 0.445 M 0.01 М |
| ТЕ-буфер | ЭДТА Трис-HCl, рН 8.0 | 1 мМ 10 мМ | |
| 10×ПЦР буфер | ПЦР | Трис-НСl, рН 8.9 (NH4)SO4 MgCl2 Tween 20 | 670 мМ 170 мМ 1.5 мM 0.1% |
| 10×лигазный буфер | Лигирование фрагментов ДНК | Трис-HCl, рН 7.8 MgCl2 DTT АТФ БСА | 500 мМ 100 мМ 100 мМ 10 мМ 250мкг/мл |
| Раствор I | Выделение плазмидной ДНК | Глюкоза ЭДТА Трис-HCl, рН 8.0 | 50 мМ 10 мМ 25 мМ |
| Раствор II | Выделение плазмидной ДНК | NaOH SDS | 0.2 N 0.1% |
Таблица 4. Плазмиды, использованные в работе.
| Плазмиды | Описание | Ссылка |
| pCM160 | OriT, OriV, Plac, PmxaF, LacZ’, KmR | Marx and Lidstrom, 2001 |
| pET/ectA | Ген ectA из M. marina встроен в pET28b+ | Данная работа |
| pZero-2 | OriP, OriF1, Plac, KmR | “Invitrogen” |
| pZero/ectA | Ген ectA из M. marina встроен в pZero | Данная работа |
| pBSL-180 | Мини-Tn10 транспозон: ori R6K, mob, nptII R, ampR, lacI, tnp | M. F. Alexeyev, 1994 |
| pBSL-180/pmax/ectABC | Гены pmax/ectABC встроены в pBSL180 | Данная работа |
Таблица 5. Праймеры, использованные в работе.
| Праймер | Ген - мишень | Последовательность (5’-3’) |
| EctHal EctA(halN) EctA(halC) ectArev ectF HalR HalF Tra3 Hal-REV2 CR Rtn Askn Askg AskF Hal-AskF(ad) Hal-REV2 Ect-operN(hal) Ect-operC(hal) Ect-operC2(hal) RevHal HalEctR-C C 20 PmaxF PmaxR TF TR vect57 vect53 | ectA ectA ectA ectA ectA ectB ectB ectB ectB ectC ask ask ask ask ask ask ectABC ectABC ectABC ectR ectR адаптор pmax pmax pZero pZero  | TTYGT(I)TGGCARGTNGC TTCCATGGCCAAAGACGTGAACGAGAT TTAAGCTTGGCTGCGGCCGAAGTC GCAGCAGCTCAATTAAC GATGGTGGTATTGAGGAGCTGC ACCATRTCYTCRAA CGGCTTTCGTATCGGTGTGC ACCGG(T/C)ACITT(C/T)TT(C/T)AGITT(C/T)GA GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC GGIGG(A/G)TT(A/G)AANAC(A/G)CA ACCATRTCYTGYTCRAA TGTCGCCGATCAGECTTCCAAC CCTTGTGGATGATCGCCTCGA TGCTGCTGGAACACAAGAAATC CGAGGCGATCATCCAGGAGTTC GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC TTGAATTCATTAGTTAGTAGGACAAGCAA TTTGGGCCCACGCGCGACATCGAAGTGC TTAAGCTTACGAGCGACATCGAAGTGC TTCCGACAAGGCGCATTACAAGC TTTAAGCTTCAGGCGGTCATCC CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA TTGGTACCGCTTGTCGGGCCGCTTGC TTGAGCTCATCCGCGGTATCTCTCAGACGTT CCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTT GAGAGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGGAG AGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGCTAG CTCTCCCTTCTCGAATCGTAACCGTTCGTAC GAGAATCGCTGTCCTCTCCTTC |
Результаты и обсуждение
Глава 5 Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерий Methylarcula marina
5.1 Накопление эктоина галотолерантным метилотрофом Methylarcula marina
Метанольные экстракты клеток галотолерантного метилотрофа Methylarcula marina анализировали методом ВЭЖХ на содержание эктоина. При увеличении солености среды в клетках M. marina возрастает содержание эктоина, причем максимальное содержание эктоина наблюдали при 8% NaCl (рис. 4). Рост M. marina замедляется при концентрации выше 6% NaCl. Снижение уровня эктоина в клетках, растущих при солености выше 8%, по-видимому, связано с накоплением других осмолитов.