Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina (стр. 9 из 11)

5.3 Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1

Для интеграции генов биосинтеза эктоина из M. marina в хромосому Methylobacterium extorquens АМ1 был выбран вектор, мини-транспозон pBSL-180. Кассета для интеграции, входящая в состав pBSL-180, содержала конститутивный промотор метанолдегидрогеназы Pmax и ectABC гены. Данный вектор был сконструирован следующим образом. ПЦР-фрагмент, содержащий промоторную область Pmax, амплифицировали с плазмиды pCM-160, используя праймеры PmaxF-PmaxR, и клонировали по сайтам EcoRI и BamHI в pBSL-180 с образованием вектора pBSL/Pmax. ДНК-фрагмент, кодирующий гены биосинтеза эктоина ectABC, был амплифицирован из M. marina с использованием праймеров Ect-operC(hal) и Ect-operN(hal). ПЦР-фрагмент клонировали по сайтам рестрикции EcoRI и HindIII в плазмиду pBSL/Pmax c образованием pBSL/Pmax/ectABC размером около 9 т.п.н. ( Рис 14)

Рис. 14. Схема клонирования генов биосинтеза эктоина(ectABC) из M. marina под промотором метанолдегидрогеназы(Pmax) в мини-транспозон pBSL-180.

Конструкцию pBSL/Pmax/ectABC трансформировали в клетки E. coli S-17(גpir). Полученные трансформанты E. coli использовали для конъюгации в дикий штамм M. extorquens AM1. Трансформанты M. extorquens, содержащие плазмиду pBSL180/Pmax/ectABC, выращивали на агаризованой минеральной среде К с метанолом и канамицином.

Наличие интегрированной кассеты Pmax/ectABC в хромосоме M. extorquens AM1 оценивали ПЦР с праймерами PmaxF и ectArev на Pmax и ectA (Рис 15).

~700 п.н.

Рис.15 Электрофорез ПЦР продуктов генов Pmax и ectA с использованием праймеров:

PmaxF и ectARev, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Трансформанты M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) выращивали на среде К с канамицином, клетки собирали центрифугированием. Экстракцию эктоина из клеток метанолом проводили в течение 2 ч. В полученных метанольных экстрактах количество эктоина анализировали методом ВЭЖХ на хроматографе высокого давления Prominence, оснащенным детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония).

В полученных трансформантах M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) был обнаружен эктоин в концентрации 75 мкг на 100 мг сухих клеток (Рис. 16с), что свидетельствует об экспрессии генов ectABC с промотора Pmax.

А)

Б)

С)

Рис. 16 Анализ накопления эктоина используя метод ВЭЖХ: а) контроль эктоина (“Sigma”), б) дикий штамм M. extorquens AM1, с) рекомбинантный штамм M. extorquens AM1.

Глава 6 Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

6.1 Клонирование и экспрессия генa ectА из M. marina

Для конструирования продуцента ДАБ-ацетилтрансферазы ген ectА клонировали в экспрессирующий вектор pET28, определяющий синтез рекомбинантного белка с дополнительными 6 His на С-конце. Полученной плазмидой pETectA трансформировали E. coli BL21(DE3). В растворимой фракции лизата клеток E. сoli, после индукции ИПТГ, методом денатурирующего гель-электрофореза в присутствии SDS обнаружен белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе около 20 кДа (Рис. 17), которая согласуется c рассчитанной на основе аминокислотной последовательности (18.88 кДа).

Рис. 17. Электрофорез в 12.5%-ном SDS-ПААГ: 1 - маркерные белки; 2 – ДАБ-ацетилтрансфераза

В контрольных клетках E. coli (выращенных без индуктора) соответствующая белковая полоса отсутствовала. Очистку белка проводили методом аффинной хроматографии на Ni²⁺-NTA агарозе. В результате был получен гомогенный препарат EctA-His₆-tag (Рис. 16). Электрофоретическая подвижность белка EctA из M. marina соответствует молекулярной массе около 20 кДа, которая согласуется c теоретически рассчитанным значением 20.0 кДа. При гель-фильтрации полученного препарата на Ultrogel AcA54 пик активности белков соответствовал молекулярной массе 40 кДа, что соответствует молекулярной массе гомодимерной формы данного фермента.

Физико-химические свойства ДАБ-ацетилтрансферазы. Температурный оптимум фермента составил +15°C (Рис. 18). Фермент активен в диапазоне рН от 7 до 9 с оптимумом при рН 8 (Рис. 19).

Рис.18 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от температуры.

Рис.19 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от pH.

Ранее ДАБ-ацетилтрансфераза была частично охарактеризована у H. elongata (Ono et al., 1999), Mm. alcaliphilum 20Z (Reshetnikov et al., 2006), M. alcalica и M. talassica (Mustakhimov et al., 2008). Необычно низкий температурный оптимум – около 15ºС является главной отличительной особенностью этого фермета у M. marina по сравнению с ДАБ-ацетилтрнсферазами из выделенными из Mm. alcaliphilum 20Z, M. thalassica и M. alcalica. Общим свойством ферментов из вышеперечисленных метилотрофов и M. marina является близкая электофоретическая подвижность, соответствующая ~20 кДа (табл. 6). Однако, по некоторым свойствам ДАБ-ацетилтрансфераза из M. marina отличается от ферментов из Mm. alcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica, имеющих максимальные активности при температурах, соответственно, 20, 35, 30°C и рН 9.5, 9.0 и 8.5.

Таблица 6. Свойства ДАБ-ацетилтрансфераз галофильных бактерий.

Свойства	M. thalassica	M. alcalica	M. alcaliphilum	M. marina
Оптимум pH	8.5	9.5	9.5	8
Оптимум темпратуры, ºC	30-35	30-35	20	15
Молекулярная масса (SDS-ПААГ электрофорез)	20 kДa	20 kДa	20 кДa	20 кДa
Молекулярная масса (гель фильтрация)	40 kДa	40 kДa	40 кДa	40 кДa
K_м (ДАБ)	0.365 мM	0.375 мM	0.465 мM
K_м (ацетил-КоА)	76 мкM	30 мкM	36.7 мкM
Ингибиторы (1 мM)	Zn²⁺ Cd²⁺ Cu²⁺	Zn²⁺ Cd²⁺ Cu²⁺	Zn ²⁺ Cd ²⁺
Оптимальная концентрация KCl, М	0	0	0.25 М
Оптимальная концентрация NaCl, М	0	0	0.1-0.2 М	0.1 М
Стабильность	Стабилен ^*	Стабилен*	Стабилен *	Нестабилен ^*

Как показал анализ транслированных аминокислотных последовательностей, из ферментов синтеза эктоина (EctA, EctB, EctC), EctA имеет наиболее высокую степень дивергенции (25-80%), что коррелирует с различиями в свойствах этого фермента. Это также свидетельствует о том, что в процессе длительной адаптации M. marina к соответствующим условиям среды обитания ферменты биосинтеза эктоина, возможно, подвергались «вертикальной» эволюции, адаптируясь к экофизиологическим особенностям вида.

Итак, данная работа существенно дополняет представления о разнообразии генов и ферментов биосинтеза эктоина, демонстрируя на примере аэробных метилотрофов, что, наряду с высокой консервативностью пути биосинтеза эктоина у разных галофильных бактерий имеются различия в организации есt-генов и свойствах кодируемых ими ферментов. Дальнейшее изучение пути биосинтеза эктоина у галофильных метилотрофных бактерий на биохимическом и генетическом уровнях перспективно в плане расширения и углубления теоретических представлений о механизмах галоадаптации, а также для разработки биотехнологического процесса получения этого мультифункционального биопротектора.

Выводы

1. Используя методологию ПЦР (включая инвертированную и векторетную ПЦР), у галотолерантной метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina определены нуклеотидные последовательности генов ectA, ectB, ectC, ask и предполагаемого гена-регулятора ectR. Обнаружено, что гены синтеза эктоина у Methylarcula marina локализованы в четырехгенном опероне ectABC-ask.

2. Клонированием и экспрессией гена ectA из M. marina в Escherichia coli получен элетрофоретически гомогенный препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Определены некоторые физико-химические свойства рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Фермент является гомодимером с м.м. субединицы 20 кДа и проявляет максимальную активность при температуре 15°C и рН 8.0 .

3. Показано, что рекомбинантный негалофильный метилотрофный штамм Methylobacterium extorquens AM1, трансформированный плазмидой, содержащей гены ectABC из M. marina, синтезирует эктоин (75 мкг в 100 мг сухих клеток).

Список литературы

1. Гальченко В.Ф., Абрамочкина Ф.Н., Безрукова Л.В., Соколов Е.Н., Иванов М.В. (1988) Видовой состав аэробной метанотрофной микрофлоры Черного моря. // Микробиология. 57(2):305-311.