Смекни!
smekni.com

Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие (стр. 2 из 11)

Существенный практический выход имеют данные о механизме фитогормонального действия гуминового комплекса, позволяющие диагностировать комплексную устойчивость сортообразцов к патогенам. Метод биотестирования (применения тест-систем) может служить в качестве метки в иммуноферментном анализе и предшествовать испытанию препаратов в полевых условиях.

Представлены рекомендации и разработан регламент применения гуминового комплекса при культивировании сельскохозяйственных культур.

Материалы исследования используются в учебном процессе кафедры общей, биологической, фармацевтической химии и фармакогнозии МИ ОГУ и кафедр физиологии и биохимии растений, биотехнологии и кормопроизводства ОГАУ при чтении курсов "Биотехнология", "Экология и охрана природы", "Физиология растений"; при выполнении дипломных проектов и кандидатских диссертационных работ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Международной научно-практической конференции "Экология и жизнь" (Пенза, 2004), Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), Международной научной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии в исследованиях молодых ученых" (Астрахань, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы химии и методики ее преподавания" (Нижний Новгород, 2006, 2009), VI, VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика – 2006" (Самара, 2006) "Экоаналитика – 2009" (Йошкар-Ола, 2009), II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием (к юбилею академика Ю.А. Золотова) (Краснодар, 2007), Всероссийском симпозиуме "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях" (к юбилею профессора О.Г. Ларионова) (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции "Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды" (Оренбург, 2007), I, II Международной научно-практической конференции "Вермикультивирование и вермикомпостирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы достижения" (Минск, Белоруссия, 2007, 2010), 55, 56 Всероссийской научно-практической конференции химиков с международным участием "Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования" (С-Петербург, 2008, 2009), Всероссийской научно-практической конференции "Биотехнология. Биомедицинская инженерная и технология современных социальных практик" (Курск, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 работ, в том числе коллективная монография.

Декларация личного участия автора. Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в формировании направления, активном участии во всех этапах исследования, постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации и обсуждении экспериментальных данных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Предложенная методология анализа гумусовых кислот методами ВЭЖХ и сканирующей микрокалориметрии позволяют контролировать процесс гумификации.

2. Существуют корреляционные зависимости между структурно-групповым, молекулярно-массовым составом гумусовых кислот и источником происхождения (субстратом), периодом, а также временем вермикомпостирования, подтверждающиеся методами элементарного анализа, спектроскопии ЯМР на ядрах 13С, эксклюзионной хроматографии.

3. Химическая структура и биохимические эффекты могут различаться в зависимости от способов извлечения, очистки и фракционирования препаратов; прогнозирование особенностей их свойств по общим элементам структуры возможно путем экспериментального анализа.

4. Природные компоненты препарата гуминового комплекса обладают иммуномоделирующими свойствами и могут служить основой для создания новых средств защиты растений.

5. Ферменты антиоксидантной системы клеток: супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза являются диагностическим тестом на выявление биологической активности и подбор эффективных концентраций препаратов.

6. Полученный препарат гуминового комплекса усиливает пероксидазозависимый иммунитет и повышает продуктивность сельскохозяйственных культур.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 356 страницах машинописного текста, содержит 121 рисунок, 39 таблиц и состоит из введения, 6 глав, заключения, основных выводов и списка литературы, приложения. Список цитируемой литературы включает 430 наименований, из которых 150 зарубежные.

Настоящая работа представляет собой часть плановых научно-исследовательских работ Орловского государственного университета, Орловского государственного аграрного университета. Исследования проводились также в сотрудничестве с Всероссийским научно- исследовательским институтом зернобобовых и крупяных культур РАСХН в рамках программы ГНЦ "Разработка методов повышения иммунных свойств, диагностики и интегрированных систем защиты зернобобовых и крупяных культур от болезней и вредителей"; институтом биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН.


Содержание работы

Во введении обосновывается актуальность исследования, его практическая и теоретическая значимость; сформулированы цель и основные задачи работы; намечены пути их реализации.


1. Общая характеристика и методы исследования гуминовых веществ различных природных объектов (литературный обзор)

В главе представлен свод основных работ, посвященных общей характеристике биогумуса и гуминовых веществ; рассмотрению состава, функций гуминовых веществ в почвенных экосистемах; физиолого-биохимической характеристике и применению их в медицине. Поскольку основной составной частью гуминовых веществ являются гумусовые кислоты, то особое внимание уделено способам выделения, исследованию состава и свойств гумусовых кислот. Анализ литературных данных дает возможность охарактеризовать качественно и количественно с использованием новейших физико-химических методов исследования гумусовые кислоты, выделенные из различных природных объектов.


2. Методики получения препаратов биогумуса и гумусовых кислот. Объекты и методы исследования

Биогумус как основа для получения биологически активных веществ произведен в результате жизнедеятельности элитной промышленной линии дождевых (компостных) червей Владимирский гибрид "Старатель". Выращивали червей на различных субстратах (компосты: конский, свиной, птичий; осадок сточных вод). Для исследований получены образцы биогумуса разного периода созревания: с января по апрель – "зимний"- образец, с апреля по октябрь – "летний" - образец; разного срока созревания (1,5 месяца компостирования, 3 месяца, 6 месяцев).

Агрохимические и микробиологические характеристики биогумуса проводили по следующим методикам: определение фосфора и калия по Кирсанову в модификации ЦИНАО, количество аммиачного и нитратного азота в почве методом Корнфильда (Радов А.С. и др., 1985); содержание золы, концентрацию водородных ионов в субстратах и биогумусе по Петербургскому А.В. (1968); аммонифицирующую активность и содержание нитратов по Радову А.С. (1985). Чистые культуры микроорганизмов выращивали на среде Чапека. Целлюлозоразрушающую активность определяли модифицированным методом Кристенсена (Ежов Г.И., 1981).

Водные экстракты биогумуса получали добавлением к 20 г сухих образцов вермикомпостов и контрольного образца (компоста) 100 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,6). Экстракцию проводили при перемешивании магнитной мешалкой и комнатной температуре. Полученные суспензии центрифугировали в течение 30 мин при 10000 об/мин (центрифуга – Т-24 , MLШ Германия). В супернатантах определяли содержание растворимых веществ.

Спиртовые экстракты получали так же как описано выше, для водной экстракции. Содержание экстрагированных веществ определяли методом высушивания до постоянного веса.

Протеолитическую активность экстрактов исследовали по отношению к гемоглобину, растворенному в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,6). Оптическую плотность супернатантов инкубируемой смеси измеряли спектрофотометрически.

Амилолитическую активность экстрактов исследовали по отношению к 1% суспензии картофельного крахмала в 50 мМ фосфатном буфере с рН 7,6. Методика основана на определении содержания редуцирующих групп путем окисления карбонильной группы моно-, ди-, олиго- и полисахаридов до карбоксильной 3,5 - динитросалициловой кислотой, что приводит к переходу окраски от желтой к красно-бурой.

Выделение гуминовых кислот и фульвокислот. Навески образцов для удаления солей и карбоксигидратов обрабатывали 0,1N раствором HCl, затем перемешивали на магнитной мешалке и центрифугировали. Из полученных осадков методом щелочной экстракции извлекали гуминовые кислоты и фульвокислоты. Процедура экстракции была проведена 11 раз. Полнота экстракции контролировалась метода ВЭЖХ.

Выделение гиматомелановых кислот. Взвешенные препараты гуминовых кислот помещали в виалы и растворяли в минимальном объеме 1N раствора NaOH при перемешивании магнитной мешалкой. После полного растворения проводили спиртовую экстракцию (метанол, этанол и пропанол) в течение 12 часов под аргоном. Полученные суспензии центрифугировали, супернатанты помещали в виалы. Концентрацию ГМК в растворе определяли методом высушивания до постоянного веса за вычетом сухого веса высушенного растворителя (спирт с 0,1 N раствор NaOH). При исследованиях методом ВЭЖХ использовали растворы ГМК с концентрацией 1 мг/мл.

Все используемые реактивы имели марку "х.ч." и "ч.д.а.".

Хроматографические исследования гуминовых кислот проводили на хроматографе "Gilson", оснащенным компьютером с программой приема и обработки хроматографических данных. Сбор и обработка хроматографических данных осуществляется через программу Мультихром или Gilson Unipoint. Измерения проводили в изократическом, градиентном и обращеннофазовом режимах. Детектирование хроматографических пиков осуществлялось УФ-детектором при 220 и 280 нм. Для хроматографирования использовали следующие колонки: Alltima C8 (250x4,6 мм; 5 мкм); Macrosphere RP 300 C8 (250x4,6 мм; 5 мкм); Platinum EPS C18 (250x4,6 мм; 5 мкм). Все используемые реактивы имели марку "Для ВЭЖХ".