Существенный практический выход имеют данные о механизме фитогормонального действия гуминового комплекса, позволяющие диагностировать комплексную устойчивость сортообразцов к патогенам. Метод биотестирования (применения тест-систем) может служить в качестве метки в иммуноферментном анализе и предшествовать испытанию препаратов в полевых условиях.
Представлены рекомендации и разработан регламент применения гуминового комплекса при культивировании сельскохозяйственных культур.
Материалы исследования используются в учебном процессе кафедры общей, биологической, фармацевтической химии и фармакогнозии МИ ОГУ и кафедр физиологии и биохимии растений, биотехнологии и кормопроизводства ОГАУ при чтении курсов "Биотехнология", "Экология и охрана природы", "Физиология растений"; при выполнении дипломных проектов и кандидатских диссертационных работ.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Международной научно-практической конференции "Экология и жизнь" (Пенза, 2004), Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), Международной научной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии в исследованиях молодых ученых" (Астрахань, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы химии и методики ее преподавания" (Нижний Новгород, 2006, 2009), VI, VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика – 2006" (Самара, 2006) "Экоаналитика – 2009" (Йошкар-Ола, 2009), II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием (к юбилею академика Ю.А. Золотова) (Краснодар, 2007), Всероссийском симпозиуме "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях" (к юбилею профессора О.Г. Ларионова) (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции "Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды" (Оренбург, 2007), I, II Международной научно-практической конференции "Вермикультивирование и вермикомпостирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы достижения" (Минск, Белоруссия, 2007, 2010), 55, 56 Всероссийской научно-практической конференции химиков с международным участием "Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования" (С-Петербург, 2008, 2009), Всероссийской научно-практической конференции "Биотехнология. Биомедицинская инженерная и технология современных социальных практик" (Курск, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 работ, в том числе коллективная монография.
Декларация личного участия автора. Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в формировании направления, активном участии во всех этапах исследования, постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации и обсуждении экспериментальных данных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Предложенная методология анализа гумусовых кислот методами ВЭЖХ и сканирующей микрокалориметрии позволяют контролировать процесс гумификации.
2. Существуют корреляционные зависимости между структурно-групповым, молекулярно-массовым составом гумусовых кислот и источником происхождения (субстратом), периодом, а также временем вермикомпостирования, подтверждающиеся методами элементарного анализа, спектроскопии ЯМР на ядрах 13С, эксклюзионной хроматографии.
3. Химическая структура и биохимические эффекты могут различаться в зависимости от способов извлечения, очистки и фракционирования препаратов; прогнозирование особенностей их свойств по общим элементам структуры возможно путем экспериментального анализа.
4. Природные компоненты препарата гуминового комплекса обладают иммуномоделирующими свойствами и могут служить основой для создания новых средств защиты растений.
5. Ферменты антиоксидантной системы клеток: супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза являются диагностическим тестом на выявление биологической активности и подбор эффективных концентраций препаратов.
6. Полученный препарат гуминового комплекса усиливает пероксидазозависимый иммунитет и повышает продуктивность сельскохозяйственных культур.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 356 страницах машинописного текста, содержит 121 рисунок, 39 таблиц и состоит из введения, 6 глав, заключения, основных выводов и списка литературы, приложения. Список цитируемой литературы включает 430 наименований, из которых 150 зарубежные.
Настоящая работа представляет собой часть плановых научно-исследовательских работ Орловского государственного университета, Орловского государственного аграрного университета. Исследования проводились также в сотрудничестве с Всероссийским научно- исследовательским институтом зернобобовых и крупяных культур РАСХН в рамках программы ГНЦ "Разработка методов повышения иммунных свойств, диагностики и интегрированных систем защиты зернобобовых и крупяных культур от болезней и вредителей"; институтом биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН.
Содержание работы
Во введении обосновывается актуальность исследования, его практическая и теоретическая значимость; сформулированы цель и основные задачи работы; намечены пути их реализации.
1. Общая характеристика и методы исследования гуминовых веществ различных природных объектов (литературный обзор)
В главе представлен свод основных работ, посвященных общей характеристике биогумуса и гуминовых веществ; рассмотрению состава, функций гуминовых веществ в почвенных экосистемах; физиолого-биохимической характеристике и применению их в медицине. Поскольку основной составной частью гуминовых веществ являются гумусовые кислоты, то особое внимание уделено способам выделения, исследованию состава и свойств гумусовых кислот. Анализ литературных данных дает возможность охарактеризовать качественно и количественно с использованием новейших физико-химических методов исследования гумусовые кислоты, выделенные из различных природных объектов.
2. Методики получения препаратов биогумуса и гумусовых кислот. Объекты и методы исследования
Биогумус как основа для получения биологически активных веществ произведен в результате жизнедеятельности элитной промышленной линии дождевых (компостных) червей Владимирский гибрид "Старатель". Выращивали червей на различных субстратах (компосты: конский, свиной, птичий; осадок сточных вод). Для исследований получены образцы биогумуса разного периода созревания: с января по апрель – "зимний"- образец, с апреля по октябрь – "летний" - образец; разного срока созревания (1,5 месяца компостирования, 3 месяца, 6 месяцев).
Агрохимические и микробиологические характеристики биогумуса проводили по следующим методикам: определение фосфора и калия по Кирсанову в модификации ЦИНАО, количество аммиачного и нитратного азота в почве методом Корнфильда (Радов А.С. и др., 1985); содержание золы, концентрацию водородных ионов в субстратах и биогумусе по Петербургскому А.В. (1968); аммонифицирующую активность и содержание нитратов по Радову А.С. (1985). Чистые культуры микроорганизмов выращивали на среде Чапека. Целлюлозоразрушающую активность определяли модифицированным методом Кристенсена (Ежов Г.И., 1981).
Протеолитическую активность экстрактов исследовали по отношению к гемоглобину, растворенному в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,6). Оптическую плотность супернатантов инкубируемой смеси измеряли спектрофотометрически.
Амилолитическую активность экстрактов исследовали по отношению к 1% суспензии картофельного крахмала в 50 мМ фосфатном буфере с рН 7,6. Методика основана на определении содержания редуцирующих групп путем окисления карбонильной группы моно-, ди-, олиго- и полисахаридов до карбоксильной 3,5 - динитросалициловой кислотой, что приводит к переходу окраски от желтой к красно-бурой.
Выделение гуминовых кислот и фульвокислот. Навески образцов для удаления солей и карбоксигидратов обрабатывали 0,1N раствором HCl, затем перемешивали на магнитной мешалке и центрифугировали. Из полученных осадков методом щелочной экстракции извлекали гуминовые кислоты и фульвокислоты. Процедура экстракции была проведена 11 раз. Полнота экстракции контролировалась метода ВЭЖХ.
Выделение гиматомелановых кислот. Взвешенные препараты гуминовых кислот помещали в виалы и растворяли в минимальном объеме 1N раствора NaOH при перемешивании магнитной мешалкой. После полного растворения проводили спиртовую экстракцию (метанол, этанол и пропанол) в течение 12 часов под аргоном. Полученные суспензии центрифугировали, супернатанты помещали в виалы. Концентрацию ГМК в растворе определяли методом высушивания до постоянного веса за вычетом сухого веса высушенного растворителя (спирт с 0,1 N раствор NaOH). При исследованиях методом ВЭЖХ использовали растворы ГМК с концентрацией 1 мг/мл.
Все используемые реактивы имели марку "х.ч." и "ч.д.а.".
Хроматографические исследования гуминовых кислот проводили на хроматографе "Gilson", оснащенным компьютером с программой приема и обработки хроматографических данных. Сбор и обработка хроматографических данных осуществляется через программу Мультихром или Gilson Unipoint. Измерения проводили в изократическом, градиентном и обращеннофазовом режимах. Детектирование хроматографических пиков осуществлялось УФ-детектором при 220 и 280 нм. Для хроматографирования использовали следующие колонки: Alltima C8 (250x4,6 мм; 5 мкм); Macrosphere RP 300 C8 (250x4,6 мм; 5 мкм); Platinum EPS C18 (250x4,6 мм; 5 мкм). Все используемые реактивы имели марку "Для ВЭЖХ".