Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие (стр. 4 из 11)
Исследование по выделению и идентификации грибковых сообществ в компосте и вермикомпосте показали, что в компосте доминируют грибы родов Mucor, Fusarium, Penicilium и Trichoderma. Общее количество почвенных грибов составляло до 60 тыс/г образца, количество колоний рода Fusarium составляло 9 - 11 тыс/г образца, что составляет 15 - 18% от общего количества (рис. 1 (а)).
а) 
б) 
в)Рисунок 1. Состав грибной микрофлоры в компосте (а), биогумусе зимнем (б), биогумусе летнем (в)
По мере компостирования биогумуса доминирующее положение занимают грибы pода Trichoderma, вытесняя другие виды, в том числе и представителей патогенного рода Fusarium (рис. 1 (б, в)). В последнем образце насчитывалось 3 - 5 тыс/г образца представителей сапрофитной микрофлоры – грибов рода Penicilium, остальное приходилось на колонии pода Trichoderma. Биогумус по мере созревания обогащается грибами - антагонистами (Trichoderma) и тем самым приобретает свойства оздоравливающего действия.
Знание микробиологических свойств и их связи с полезными и вредными свойствами вермикомпоста необходимы для контроля производства и получения высококачественных продуктов. Методы, основанные на определении видового состава сообщества компоста, эффективны для выявления фитопатогенной микрофлоры и санитарных микроорганизмов. Характеристики такого типа необходимы для определения гигиенических качеств вермикомпостов. Кроме того, изменение функциональной структуры микробиологических сообществ может быть приемлемым для определения степени зрелости вермикомпостов.
Экстракцию водорастворимых веществ компостов и вермикомпостов проводили 0,1 М фосфатным буфером при рН = 7,6. Показано (рис. 2) , что из субстрата, не обработанного червями максимально экстрагируется 4 мг/мл вещества, в то время как из образца, полученного с января по апрель (зимний), экстрагируется 1,6 мг/мл, а из образца, полученного в период с апреля по октябрь (летний) – 1,2 мг/мл.
а)
б)Рисунок 2. Динамика экстрагируемости водорастворимых веществ (экстракция 0,1 M фосфатным буфером; pH 7,6) - а) из компоста; б) из вермикомпоста: 1 - зимний образец вермикомпоста, 2 - летний образец вермикомпоста.
Из выше приведенных данных следует, что не менее половины (4/1,6 = 2,5; 4/1,2 = 3,5) водорастворимых веществ после обработки образцов червями, по-видимому, гумифицируется. Следует также отметить, что оставшиеся после обработки компоста червями органические вещества быстрее вымываются водой (3 ч), в сравнении с контролем (16 ч). Экстракты компоста и вермикомпостов были исследованы методом гель-хроматографии. При существующей неопределенности структуры ГВ возможность создания универсальных ММ стандартов на сегодняшний день практически исключена. В этой ситуации представляется целесообразным оценить эффективность гель-хроматограммы приняв во внимание распределение в хроматографическом профиле отдельных фракций, различающихся по физико-химическим свойствам. Площади, занимаемые максимумами, пропорциональны количественному содержанию фракций. На рисунках 3(а) и 3(б) приведены гель – хроматограммы для экстрактов зимнего и летнего образцов вермикомпостов. Хроматограммы содержат по одному пику с одинаковым временем удерживания на колонке, что свидетельствует о близких молекулярных массах веществ, содержащихся в образцах. Асимметрия пиков указывает на присутствие двух или нескольких веществ с близкой молекулярной массой.
а) 
б)Рисунок 3. Гель - хроматограмма водного экстракта биогумуса: а) образец - зимний, б) образец – летний; детектирование-254 нм.
На рисунке 4 приведена гель - хроматограмма для образца компоста, не обработанного червями – контроль.
ВремяРисунок 4. Гель - хроматограмма водного экстракта компоста контрольного образца, детектирование – 254 нм.
Приведенная хроматограмма содержит, помимо основного пика, дополнительный пик-1, соответствующий большей молекулярной массе вещества. Этот факт говорит о том, что возможна ассоциация молекул гумусовых кислот и образование в растворе статических клубков. При различных значениях рН конформация молекул может изменяться вследствие электростатического отталкивания ионизированных карбоксильных групп, приводя к увеличению линейных размеров молекул.
Увеличение доли высокомолекулярной фракции в экстрактах вермикомпостов объясняется, вероятно, тем, что при участии червей меняется природа гумусового вещества, происходит обогащение новообразованными гуминовыми кислотами, возникающими за счет преобразования растительных остатков. Кроме того, усиливается микробиологическая активность, что в свою очередь приводит к усилению процессов гумификации и образованию более зрелых биотермодинамически устойчивых ГК, имеющих большую молекулярную массу и обеспечивающих повышение плодородия почв.
Методом гель-фильтрации определены молекулярные массы белков биогумуса. Молекулярная масса белка из биогумуса вычислена по нижеследующему уравнению:
Y = - 0,3829х + 2,083 исходя из К = 0,65 для белка из биогумуса. Она равна »27 кДа.
Для определения жирных кислот в препаратах экстрактов биогумуса и компоста использовали метод газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. В таблице 3 приведены данные жирнокислотного состава в исследованных препаратах.
Таблица 3 Содержание жирных кислот в биогумусе
| № п./п. | Название вещества | летний | зимний | контроль |
| Содержание в гумусе, нг/г | ||||
| 1 | Октадекановая | 500 | 370 | 200 |
| 2 | Метилэйказоновая | 15 | 10 | 5 |
| 3 | Доказоновая | 300 | 250 | 150 |
| 4 | Метилдоказоновая | 20 | 15 | 5 |
| 5 | Триказоновая | 10 | 5 | - |
| 6 | Тетраказоновая | 150 | 100 | 50 |
| 7 | Пентаказоновая | 5 | 5 | - |
| 8 | Гексаказоновая | 20 | 15 | 5 |
| 9 | Гептаказоновая | 5 | - | - |
| 10 | Метилгептадекановая | 120 | 90 | 40 |
| 11 | Октодеценовая | 500 | 400 | 200 |
| 12 | Гептадекановая | 120 | 100 | 100 |
| 13 | Гексадекановая | 400 | 320 | 270 |
| 14 | Пентадекановая | 200 | 170 | 120 |
Содержание жирных кислот в контрольном образце и образцах, обработанных червями, неодинаково. Содержание жирных кислот в препаратах летнего образца выше, чем в зимнем образце, а в препарате, не обработанном червями (контроль) оно наиболее низкое. Из литературы известно, что с ростом гумификации содержание жирных кислот действительно возрастает.
Протеолитическую активность экстрактов биогумуса и компоста исследовали по отношению к 1%-ого раствору гемоглобина. Оптическую плотность супернатантов инкубируемой смеси гемоглобина и экстрактов биогумуса измеряли в 10 мм кварцевых кюветах при 280 нм против 10% раствора ТХУ в фосфатном буфере. Измерения проводили на спектрофотометре Specord UV/VIS(Carl Zeiss,Jena, Германия). Результаты анализа приведены на рисунке 5.
Кинетика протеализа
а) 
б)Рисунок 5. Зависимость изменения оптической плотности растворов ТХУ (10%) растворимой фракции 1% раствора гемоглобина от времени инкубирования с водными растворами экстрактов а) компоста, б) биогумуса: 1 – зимний образец, 2 – летний образец.
Определено, что препарат биогумуса зимний (1) обладает более высокой протеолитической активностью, чем препарат летний (2) (рис. 5 (б)). Кинетические кривые имеют типичную форму для кинетики ферментативных гидролитических процессов.
Результаты анализа образца компоста, не обработанного червями, приведены на рисунке 5 (а). Видно, что контрольный образец не обладает протеолитической активностью, в отличие от зимнего и летнего образцов.
При исследовании амилолитической активности экстрактов вермикомпостов и компоста по отношению картофельному крахмалу (50 мМ фосфатный буфер, рН 7,6) в течение 24 часов ее обнаружить не удалось. Возрастания оптической плотности от времени инкубирования получено не было. Отсутствие амилолитической активности, возможно, связано с низким количеством амилаз в вермикомпосте и компосте.
4. Выделение и сравнительное исследование физико-химических свойств гумусовых кислот методами ВЭЖХ и спектрофотометрии
Углубленное изучение свойств и природы гумусовых веществ возможно с применением современных физико-химических методов исследования. Они позволяют раскрыть генетические особенности гумусовых веществ, развивающихся в разных условиях.
Гуминовые кислоты являются основным гумусовым компонентом. Они не растворимы в кислоте и спирте, у них средний молекулярный вес и темная окраска. Извлеченные методом экстракции из вермикомпостов разного периода созревания гуминовые кислоты были исследованы методами спектрофотометрии и ВЭЖХ. На основании УФ-спектров установлено наличие в гуминовых кислотах ароматических групп. Отношение оптической плотности при 280 нм к оптической плотности при 220 нм – D280/D220, характеризует относительное содержание ароматических групп в гуминовых кислотах. Данные спектрофотометрии не показали значительного изменения относительной ароматичности в образцах компоста и вермикомпостов (гуминовые кислоты компоста - D280/D220=0,47; гуминовые кислоты вермикомпостов D280/D220=0,45). Однако следует учесть, что при спектрометрическом исследовании гуминовые кислоты в растворе находятся в агрегированном состоянии, при хроматографии эти агрегаты разрушаются, поэтому данные хроматографического исследования являются более объективными.