Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов (стр. 5 из 11)

В опытах Х.Г. Михаеляна (1988) в культуральной среде с концентрацией гентамицина 50 мкг/мл созревание ооцитов достигло 100%, из них 84% клеток созрело до стадии метофазы II, в контроле (без антибиотиков) до этой же стадии созревало только 70%.

Для подавления же большинства микроорганизмов достаточна концентрация гентамицина 4 мкг/мл (Д.Ф. Осидзе, В.Ф. Ковалев, К.С. Масловский, 1981).

В 1986 г. для санации вымывных буферных сред в лаборатории трансплантации А.Д. Бугровым, И.М. Величко и соавт. предложен и испытан комплекс антибиотиков гентамицин + пенициллин (ампициллин) в концентрациях 12 мкг/мл и 100 Ед/мл, соответственно. Эта комбинация дала хороший антимикробный эффект по отношению к микроорганизмам, встречающимся в половых путях доноров (E.coli, Staph. aureus, Bac.subtilis, Pseudomonas aeruginosa). По данным И.С. Чекмана (1986) гентамицин не совместим с антибиотиками из группы бензилпенициллин, совместим с изотоническим раствором хлористого натрия. При совместном применении гентамицина с ампициллинонатриевой солью, карбенициллином или линкомицином усиливается их антибактериальный эффект.

Т.А. Зацепилова и А.Н. Кудрин (1983) установили, что переход лекарственных веществ из жидкости матки через оболочку морулы и бластоцисты зависит от его молекулярной массы.

Многие авторы независимо друг от друга определяли влияние антибиотиков на яйцеклетку. Так, М.Ф. Карашаев (1987) установил отрицательное влияние комплекса антибиотиков пенициллин + стрептомицин (100 Ед/мл и 50 мкг/мл) на созревание ооцитов.

Таким образом, можно сделать вывод, что применением антибиотиков, как компонентов сред, можно контролировать развитие микрофлоры. Однако не все антибиотики, которые обладают широким спектром антимикробного действия, можно использовать для санации спермы, промывных буферных сред, эмбрионов. Лучшими комплексами антибиотиков для них являются аминогликозиды в сочетании с пенициллинами, примером которых, является гентамицин. Из пенициллинов в комбинации с гентамицином лучше всего сочетается ампициллин.

Анализ литературных данных показал, что несмотря на достигнутые успехи в эмбриотрансплантации, проблемными остаются вопросы по приживляемости эмбрионов. Известно много причин, влияющих на приживляемость эмбрионов, одной из которых является микробный фактор. Хотя многие известные ученые не учитывают влияние микрофлоры на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов считая, что эмбрионы с интактной зоной пеллюцида надежно защищены от микробов и вирусов. Однако в литературе есть данные о том, что некоторые вирусы и прилипают к прозрачной оболочке и заносятся вместе с эмбрионом в матку реципиента, оказывая негативное влияние на него. Недостаточное количество противоречивых данных о влиянии микроорганизмов на приживляемость эмбрионов стало основанием для проведения исследований по данной проблеме.

С целью предупреждения заноса инфекции при трансплантации отечественными и зарубежными учеными разработаны различные технологии, приемлемые в хорошо оборудованных центрах трансплантации эмбрионов. В производственных условиях необходимы дополнительные меры профилактики микробной загрязненности. Известно, что лучшими антимикробными средствами являются антибиотики. Тем не менее, в доступной для нас литературе мало данных о влиянии антибиотиков на эмбрионы. Поэтому перед нами встала задача изучить влияние различных антибиотиков и их доз для профилактики микробной контаминации на всех этапах эмбриотрансплантации.

2. Собственные исследования

2.1 Цель и задачи

Целью нашей работы была разработка методов профилактики и санитарного контроля технологических процессов при трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота.

Для достижения этой цели нами поставлены на разрешение следующие задачи:

1. Изучить бактериальную контаминацию половых путей телок-реципиентов в фолликулярную и лютеальную фазы полового цикла.

2. Изучить влияние антибактериальных препаратов на микрофлору половых путей после их санации непосредственно перед извлечением и пересадкой эмбрионов.

3. Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов для санации половых путей.

4. Испытать антибиотики для санации промывных буферных сред и отмывки эмбрионов.

5. Изучить влияние испытанных нами антибактериальных препаратов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов.

2.2 Материалы и методика исследований

Все исследования по данной работе проводились в лаборатории трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Харьковского биотехнологического центра Украинской академии аграрных наук и на пункте трансплантации эмбрионов опытного хозяйства «Кутузовка». Работа выполнялась в период с июля 2000 года по август 2001 года.

Пункт трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, построенный по типовому проекту, имеет манеж для санитарной обработки животных перед операцией, операционную, поисковую и стерильный бокс для первичной обработки эмбрионов, помещение для замораживания и хранения эмбрионов, моечную и др. В манеже и операционной расположены специальные фиксационные станки. Операционная, поисковая и стерильный бокс оборудованы бактерицидными лампами. Пункт оснащен необходимым лабораторным, технологическим оборудованием и лабораторной посудой.

Предметом исследования были коровы и телки черно-пестрой породы и полученные от них эмбрионы.

В опытном хозяйстве «Кутузовка» беспривязная система содержания на глубокой несменяемой подстилке.

Кормление животных проводили по общепринятым нормам. Рационы были сбалансированы по общей питательности, белку, фосфору, кальцию и витаминным добавкам.

Животные регулярно подвергались ветеринарно-профилактическим и санитарным обработкам, клинико-гинекологическим обследованиям, постоянно находились под ветеринарно-зоотехническим наблюдением.

Исследования проводили на коровах-донорах и телках-реципиентах с нормальным состоянием половых органов и цикличностью воспроизводительной функции. Опытная группа состояла из коров в возрасте 3–8 лет, с живой массой 500–600 кг и телок в возрасте 16–18 месяца, с живой массой 350–380 кг. В контрольную группу отбирали коров и телок методом пар-аналогов. В экспериментах использовано 25 коров-доноров и 60 телок – реципиентов. Для вызывания суперовуляции применяли препараты ФСГ.

Животные обрабатывались по 4-х дневной схеме ФСГ‑п производства фирм «Schering Corp» или» Burns Biotec» США и ФСГ-супер (Россия) в общей дозе 50 мг (Табл. 1).

Таблица 1. Схема гормональной обработки коров-доноров препаратом ФСГ‑п (50 мг) производства США

День эстрального цикла	Название препарата	Доза (мг)		Общая доза
		утро	вечер
10–12	ФСГ‑п	7	7	14
11–13	ФСГ‑п	6,5	6,5	13
12–14	ФСГ‑п	6	6	12
Простогландин	250	250	500 мкг
13–15	ФСГ‑п	5,5	5,5	11
14–16	Охота и осеменение
21–23	Нехирургическое извлечение эмбрионов

Синхронизация полового цикла доноров и реципиентов осуществлялась инъекцией экстрофана.

Осеменение коров-доноров проводилось двукратно двойной дозой замороженно-оттаянной спермыс содержанием не менее 25 млн. активных спермиев (рис. 1). Из спермодозы готовили мазки для определения патологических форм спермиев. Мазки высушивали, фиксировали и окрашивали гематоксилином Караччи. Сперму, содержащую 18% и более патологических спермиев, выбраковывали, так как высокий процент патологических спермиев снижает оплодотворяющую способность спермы.

Рис. 1. Нормальные спермии быка

Рис. 2. Патологические формы спермиев

Рис. 3. Патологические формы спермиев

Рис. 4. Патологические формы спермиев

Для бактериологических исследований использовали мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептонный бульон (МПБ), среду Китт-Тароцци, Сабуро и Булира, агар Эндо.

МПА и МПБ использовали для культивирования различных микроорганизмов неопределенного состава.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов использовали среду Китт-Тароцци (МППБ).

Среду Булира и агар Эндо применяли для культивирования кишечной палочки.

Для выращивания грибов использовали среду Сабуро.

Все среды перед бактериологическим исследованием разливали в пробирки по 5 мл. Пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали автоклавированием при температуре 120°С в течение 15–30 минут. МПА после стерилизации скашивали, установив пробирки в наклонном положении до застывания среды.

Среду, предназначенную для культивирования бактерий на чашках разливали по 20–25 мл и оставляли на несколько минут до застывания агара. Когда требовалось вырастить микроорганизмы на агарезированной среде в виде изолированных колоний, чашки после засева помещали в термостат дном вверх.

Отбор проб для бактериологических исследований проводили на всех этапах подготовки эмбрионов к трансплантации.

2.2.1 Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионами

В помещениях лаборатории, где подготавливали инструменты, оборудование, посуду, среды для получения, пересадки и криоконсервации эмбрионов, ежедневно проводили влажную уборку.

Все оборудование бокса, его стены, пол не реже одного раза в неделю мыли моющими средствами и протирали дезинфицирующими растворами. Для дезинфекции использовали 2%-й раствор хлорамина «Б». Перед работой бокс и другие помещения лаборатории облучали в течение 40–60 минут ультрафиолетовыми лучами из расчета 2–3 вт/м.