Особистий внесок здобувача. Авторка особисто здійснила аналіз літературних джерел за темою дисертації, самостійно виконала експериментальну частину роботи, зокрема, з підбору клітинної системи для культивування виробничого штаму вірусу діареї, розробила спосіб накопичення вірусної сировини для виготовлення вакцини, вивчила властивості вакцини за показниками якості, запропонувала корекцію післявакцинального імунітету за допомогою бактеріального ліпополісахариду.
Біохімічні та гематологічні дослідження здійснено спільно із співробітниками лабораторії біохімії ННЦ «ІЕКВМ», кандидатами біологічних наук Л. В. Коваленко та С. А. Михайловою.
Апробація результатів дисертації. Матеріали, подані в дисертації, доповідались і були схвалені на звітних сесіях Вченої ради і засіданнях методичної комісії ННЦ «ІЕКВМ» (2000–2007 рр.) та міжнародних науково-практичних конференціях: «Ветеринарна медицина – 2004. Сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів», (24–31 травня 2004 р., м. Феодосія), «Ветеринарна медицина – 2005. Сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва», (30 травня–4 липня 2005 р., м. Ялта).
Публікації. Основніположення дисертації опубліковано в 5 наукових працях, з них 1 одноосібна, у фахових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України, та описі отриманого деклараційного патенту.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 110 сторінках комп’ютерного друку і містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, їх узагальнення та аналіз, висновки, пропозиції виробництву, список використаної літератури за темою дисертації, додатки. Робота ілюстрована 7 рисунками і 15 таблицями. У списку літератури наявні 240 джерел, у тому числі 143 – закордонних авторів.
Робота виконана відповідно до державних і відомчих планів наукових досліджень у лабораторіях вивчення хвороб молодняка та вивчення вірусних хвороб рогатої худоби Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», а також у дослідному господарстві «Українка Слобідська» та СВК «Заповіт Леніна» Харківської області впродовж 2000–2007 років. Окремі етапи цих досліджень, зокрема біохімічні, здійснено в лабораторії біохімії ННЦ «ІЕКВМ».
Для розроблення, виробництва та випробування живої вакцини проти вірусної діареї використали такі штами: епізоотичний 25, еталонний Oregon C 24 V і виробничий ВК-1М вірусу діареї з колекції лабораторії вивчення вірусних хвороб рогатої худоби. Виробничий штам ВК-1М вірусу діареї отриманий В.І. Стеценком шляхом адаптації до розмноження епізоотичного ізоляту ВК-1, що був виділений у 1972 році від хворої на вірусну діарею ВРХ, і подальшої його атенуації шляхом серійних пасажів у культурах перещеплюваних клітин. Титр його інфекційності після 20 і 30 послідовних пасажів у культурах перещеплюваних клітин ПТ і ПО становив відповідно 6,5 і 6,8 lgТЦД50/см3. Титр інфекційності штамів 25 та Oregon C 24 V під час культивування в цих культурах становив 6,0 і 5,8 lg ТЦД 50/см3 та 6,2 і 6,0 lg ТЦД50/см3, відповідно.
Окрім того, в роботі використали ліпополісахарид (ЛПС-1), який застосовували як імуностимулятор під час імунізації тварин живою вакциною проти вірусної діареї, виготовлений за методом П.А. Красочко та В.А. Машеро (1998) шляхом лужного гідролізу бактеріальної маси культури Bacillus alvei, (штам 413), з колекції лабораторії вивчення хвороб бджіл ННЦ «ІЕКВМ».
За допомогою тест-культури Staphilococcus aureus (штам 209 Р) визначали фагоцитарну активність та фагоцитарне число нейтрофілів периферійної крові.
Культивування досліджуваних штамів вірусу діареї та накопичення вихідної вірусовміщуючої сировини для виготовлення зразків вакцини здійснювали в моношарових культурах перещеплюваних клітин ТрТ (трахея теляти), ВНК-21/13 (нирки новонародженого хом’ячка) та КСТ (коронарні судини теляти), які вирощували в суміші з рівних об’ємів середовищ Ігла та 199 з 10 % сироватки крові ВРХ виробництва ДП «Ветеринарна медицина» (м. Харків). Концентрацію та життєздатність клітин визначали за фарбуванням трипановим синім і підрахуванням живих клітин у камері Горяєва.
Експериментальні дослідження з вивчення реактогенності, нешкідливості, антигенних та імуногенних властивостей виробничого штаму ВК-1М вірусу діареї та дослідних зразків вакцини виконувались на 300 білих мишах масою 18–20 г, 60 морських свинках масою 300–400 г, 40 кроликах породи Шиншила масою 2,0–2,5 кг та 99 телятах 21–28-добового (n=36) та 3–4-місячного віку (n=63).
Чутливість перещеплюваних клітин до вірусу діареї вивчали в п’яти послідовних пасажах з визначенням його інфекційності шляхом титрування, для чого готували 10‑кратні розведення, якими заражали по 4 тест-об’єкти (пробірочні культури клітин). Результати обраховували за методом Ріда і Менча. За титр інфекційності приймали максимальне розведення вірусу, що спричиняло деструкцію клітин у 50 % флаконів, і виражали в тканинних цитопатогенних дозах (ТЦД 50/см3). Антигенну активність вірусу та імуногенність зразків вакцини досліджували за допомогою реакції нейтралізації ЦПД вірусу специфічними антитілами в сироватках крові тварин, щеплених відповідним штамом вірусу діареї. За титр нейтралізуючої активності сироватки крові приймали ті розведення сироватки, в яких спостерігали пригнічення репродукції вірусу в 50 % культуральних флаконів (пробірок).
Імунний стан тварин оцінювали за показниками рівня вірусонейтралізуючих антитіл, функціональної активності гематогенних попередників макрофагів, зокрема макрофагальної трансформації мононуклеарів, фагоцитарного індексу, фагоцитарного числа за методом В.Н. Чеботкевича і С.И. Лютинского (1998).
Кількість імуноглобулінів визначали за G. Manchini et al. (1965) та Н. В. Кленіною із співавт. (1983), циркулюючих імунних комплексів – за методом Ю. А. Гриневича.
Лейкоцитарну формулу обраховували за кількістю елементів білої крові в мазках, пофарбованих за Романовським-Гімза.
Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали з визначенням критеріїв вірогідності за Ст’юдентом. Облік результатів обраховували за допомогою персонального комп’ютера IBM PC/AT, програми «Excel XP» з програмного пакету MS Office XP.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Вибір клітинної системи для культивування вірусу діареї. Важливим етапом виробництва біологічних препаратів є вибір клітинної системи для репродукції вірусу, яка б забезпечувала максимальне накопичення вірусовміщуючого матеріалу. Із цією метою ми випробували три лінії перещеплюваних клітин, а саме: ТрТ, КСТ і ВНК‑21/13, які підтримуються в колекції ННЦ «ІЕКВМ». У результаті порівняльного вивчення культуральних властивостей клітин цих ліній установлена залежність накопичення їхньої біомаси від посівної концентрації та способу вирощування. Зі збільшенням посівної концентрації від 100 до 400 тисяч клітин в 1 см3 ростового середовища скорочуються терміни формування моношару як за стаціонарного (в матрасах), так і ролерного (у бутлях) способів вирощування. Зокрема, під час культивування в матрасах і бутлях ці показники для культури клітин ТрТ скорочувалися відповідно від 144 до 72 годин і від 120 до 60 годин, для КСТ – від 120 до 70 і від 72 до 40 годин, і для ВНК-21/13–від 80 до 48 і від 72 до 38 годин. За кількістю накопичення клітин у моношарі переваги мала культура КСТ (771,5 і 1449,0 тисяч клітин/см3 середовища відповідно в матрасах і бутлях порівняно з ТрТ (740 і 1400 тис/см3) і ВНК-21/13 (767 і 1440,5 тис/см3).
На підставі отриманих результатів експериментальних досліджень основних параметрів процесу вирощування клітинної біомаси культура перещеплюваних клітин КСТ визнана нами більш продуктивною як за вирощування в матрасах, так і ролерних бутлях та обрана для використання в подальшому виробництві дослідних зразків вакцини проти вірусної діареї.
Вивчення репродуктивних властивостей виробничого штаму вірусу діареї. Результати вивчення культуральних і репродуктивних властивостей трьох ліній перещеплюваних клітин визначили доцільність з’ясування в порівняльному аспекті їхньої чутливості до вірусу діареї, зокрема до штамів 25, Oregon C 24 V та ВК-1М. Із нарощуванням пасажів вірусу цитопатичні зміни в культурах клітин стабілізувалися за терміном прояву й завершення. Із ростом серійних пересівів вірусу цей термін скорочувався. У 5-му пасажі терміни завершення ЦПД становили в матрасах 48–76, а в бутлях – 42–72 години залежно від випробуваних клітин. Із посиленням адаптації до репродукції в цих клітинних культурах титр інфекційності штамів 25, Oregon C 24 V і ВК-1М ВД підвищувався майже на 1,0 lg ТЦД 50/см3. Що стосується штаму ВК-1М, то результати пасажування засвідчили його більш виражену стабільну репродуктивну здатність у досліджуваних культурах клітин. У ролерній культурі перещеплюваних клітин КСТ вона досягала максимального рівня – 7,6 lg ТЦД50/см3.
Разом із тим ми встановили пряму залежність термінів репродукції вірусу від заражаючої дози. Оптимальні показники терміну репродукції штаму ВК–1М у перещеплюваній культурі клітин забезпечувала множинність зараження з розрахунку 0,001 ТЦД50/клітину, що відповідає інфекційності вірусу 100 ТЦД50/см3. Із підвищенням множинності зараження до 0,01 ТЦД50/клітину, що становить 1000 ТЦД50/см3 у заражаючому об’ємі вірусовміщуючої суспензії, термін репродукції вірусу скорочувався в середньому на 6 годин. Але титр інфекційності кінцевої вірусовміщуючої сировини був однаковим як за множинності зараження 0,001 ТЦД50/клітину, так і 0,01 ТЦД50/клітину. У подальшому процесі напрацювання вихідної вірусовміщуючої сировини для виготовлення вакцини здійснювали зараженням культури КСТ із розрахунку 0,01 ТЦД50 вірусу на клітину.