У кроликів, яким щепили сухий зразок вакцини проти вірусної діареї зі штаму ВК‑1М, ці показники були виражені менше. Фагоцитарне число та фагоцитарний індекс у цих тварин знижувалися лише на 4,4 % і 0,4 одиниці порівняно з вихідними показниками, що свідчить про слабко виражену реактогенність вакцини з атенуйованого штаму ВК–1М вірусу діареї, тим більше, що він не призводив до проявлення вираженої лейкопенії.
Перевірка нешкідливості сухого зразка вакцини проти вірусної діареї. Нешкідливість вакцини культуральної живої проти вірусної діареї перевірялася на білих мишах і серонегативних до вірусу діареї телятах. Установлено, що вона нешкідлива для піддослідних тварин, у яких у місцях введення препарату не виявлено набряку, припухлості, затвердіння тканин або болісної реакції при пальпації. За підшкірного введення білим мишам вакцини в дозі 0,2Ч105,45ТЦД50/гол. під час спостереження впродовж 14 діб (інтервал між дворазовим щепленням вакцини) не спостерігали відхилення у їх загальному стані. У той же час у телят 5‑кратна доза (10Ч105,45 ТЦД50/гол.) вакцинного вірусу викликала незначне зниження кількості лейкоцитів. Зокрема, у теляти, в якого було виявлено одноразове підвищення температури тіла (на другу добу увечері) на 1 °С, кількість лейкоцитів понизилась від 7180±96 до 6685±114 кл./мм3 (на 495 кл./мм3), а в теляти, в якого не встановлено температурної реакції, від 7768±123 до 7463±110 (на 305 кл./мм3), що підтверджує слабку реактогенність вакцинного вірусу.
Перевірка антигенної активності вакцини. Антигенну активність сухого зразка вакцини вивчали на кроликах, з яких формували 3 групи по 5 голів у кожній. Вакцину вводили одноразово в дозах 2Ч105,45ТЦД50/гол. і 5Ч105,45ТЦД50/гол. внутрішньом’язово кроликам першої та другої груп відповідно. А третя група залишалась інтактним контролем.
Установлено залежність рівня продукованих вірусонейтралізуючих антитіл від дози (об’єму) щепленої вакцини. Так, у кроликів другої групи, яким вводилася вакцина в дозі 5Ч105,45 ТЦД50/гол., титр вірусоспецифічних антитіл уже на 7 добу був вищим на 1,0 log2 порівняно з показниками у тварин, щеплених вакциною в дозі 2Ч105,45ТЦД50/гол., хоча в подальшому процесі імунної відповіді титри антитіл до вакцинного вірусу діареї фактично вирівнювалися. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що досліджуваний зразок сухої вакцини є антигенно активним.
Вивчення імуногенних властивостей вакцини живої проти вірусної діареї. Як повідомляють Сюрин В. Н. із співавт. (1983), ІРТ, ПГ–3 і ВД з характерними клінічними ознаками неможливо відтворити в експерименті в лабораторних умовах. У зв’язку з цим імуногенність, а також захисні властивості вакцинних препаратів прийнято оцінювати за їхньою антигенною активністю. На підставі зазначеного ми вивчали показники специфічного та неспецифічного імунітетів у щеплених вакциною тварин. На першому етапі цих досліджень зразки вакцини були випробувані на морських свинках, для чого було сформовано 4 групи по 10 голів у кожній. У процесі вивчення імуногенної активності вакцини, виготовленої з атенуйованого штаму ВК‑1М ВД ВРХ, на морських свинках підтверджено високу антигенність. Вакцина викликала активну індукцію специфічних вірусонейтралізуючих антитіл. У той же час вакцина у випробуваних дозах була нешкідливою для морських свинок, серед яких не спостерігали захворювання або загибелі. У морських свинок вже на 7 добу після введення вакцини в дозах 0,5 і 1,0 см3 одно- і дворазово титр вірусонейтралізуючих антитіл був на рівні 4,33; 5,75 і 5,5 log2, поступово зростаючи на 14 добу до 5,45; 6,7 і 5,75 log2 відповідно. Після повторного введення вакцини спостерігали подальше зростання титрів вірусонейтралізуючих антитіл до 6,4 і 7,3 log2 відповідно, у той час як після одноразового введення їх титр фактично залишався на попередньому рівні (5,8 log2).
На підставі отриманих результатів з визначення антигенної активності сухого зразка вакцини на кроликах та вивчення імуногенної активності вакцини на морських свинках була підтверджена значущість дози і необхідність дворазового застосування вакцини живої проти ВД, що сприяло підвищенню титрів вірусонейтралізуючих антитіл. Отримані позитивні результати щодо нешкідливості та імуногенності для лабораторних тварин дозволили нам здійснити її випробування на сприйнятливих до вірусної діареї тваринах в умовах неблагополучного господарства. Враховуючи ті обставини, що вірус діареї є досить потужним імуносупресором і в організмі здатний пригнічувати імунологічну реактивність, перед тим, як застосувати вакцину живу проти ВД на ВРХ, ми випробували імуномодулятор з культури Bacіllus alvei.
Вивчення імуномоделюючої активності ліпополісахариду з Bac. аlvei. Як відомо, бактеріальні ліпополісахариди є поліклональними активаторами В-системи лімфоцитів (Карпуть І. М., 1993) і суттєво стимулюють неспецифічні гуморальні та клітинні ланки імунної системи (Дранкин Г. Н. и др., 1994). А якщо взяти до уваги, що фактично більша кількість скотарських господарств є неблагополучними щодо вірусної діареї, то під час застосування живої вакцини, хоча і з атенуйованого штаму, на можливо інфікованому поголів’ї не виключаються випадки біотичної взаємодії вакцинного та епізоотичного штамів вірусу і негативний вплив утворених рекомбінацій вірусу на імунну систему щеплених тварин. З урахуванням цих обставин, а також з метою пом’якшення імуносупресивної дії вірусу діареї ми використали ліпополісахарид з культури Bacіllus alvei.
Токсичність бактеріального ліпополісахариду визначали на білих мишах (по 10 голів на пробу), яким перорально вводили 0,5 см3 (162,5 мг ЛПС–1), 1 см3 (325 мг ЛПС‑1) і 2 см3 (650 мг ЛПС‑1), що становило відповідно 8,125; 16,25 і 32,5 мг/г маси тіла миші. Під час нагляду впродовж 10 діб не було виявлено змін у загальному стані піддослідних мишей, у тому числі й контрольної групи. У групі мишей, яким підшкірно вводили 0,5 мл ЛПС–1, у місцях ін’єкцій препарату не спостерігали ні набряків, ні інших локальних змін. Отримані результати засвідчили, що виготовлений ЛПС‑1 нетоксичний як за перорального, так і підшкірного введення тваринам, у яких не встановлено клініко-фізіологічних порушень у загальному стані. Миші залишалися здоровими. На підставі цих даних було проведено дослід на кроликах з метою вивчення імуномоделюючих властивостей ЛПС-1, результати якого оцінювали за трансформацією та функціональною активністю мононуклеарних попередників макрофагів, зокрема макрофагальною трансформацією мононуклеарів периферичної крові, показниками фагоцитарного індексу та фагоцитарного числа. Установлено, що ЛПС‑1 здатний підвищувати трансформативну активність попередників макрофагів, яка зростала в 1,5 рази.
Отже, результати вивчення властивостей виготовленого ЛПС‑1 свідчать про те, що він є нешкідливим для тварин, має виражені стимулюючі властивості.
З метою визначення оптимальної дози ЛПС‑1, яка б забезпечувала активізацію імунної відповіді, здійснено подальші досліди на 6 групах кроликів (по 5 голів у кожній), яким вводили внутрішньом’язово препарат у дозах 1, 2, 5, 7 і 10 мкг/кг маси тіла тварин. Нагляд за піддослідними тваринами здійснювали впродовж 14 діб. Контрольній групі вводили фізіологічний розчин.
Установлено, що ЛПС‑1 активізує ланки клітинного імунітету. Імуномодулююча дія ЛПС‑1 виявлялась уже на 7 добу в тварин усіх груп, які отримували препарат незалежно від його дози, але різною мірою щодо реакції імунокомпетентних клітин. Найбільш виражена стимулююча активність ЛПС‑1 спостерігалася у групах кроликів, які отримували 5 і 7 мкг препарату з розрахунку на кілограм маси тіла. Зокрема стабільно й достовірно підвищувалася фагоцитарна активність, де фагоцитарне число й фагоцитарний індекс зростали до 9,05–9,08 і 9,05–10,45 одиниць відповідно проти 4,46 (у середньому) в контролі. Ці показники стимулювання імунокомпетентних клітин були близькими до результатів дії ЛПС‑1 у дозі 10 мкг/кг маси тіла кроликів. Виходячи з цього, було визнано доцільним застосування ЛПС‑1 у дозі 7 мкг/кг маси тіла тварини.
Отже, результати визначення оптимальної дози ЛПС‑1 дозволили встановити, що цей препарат може застосовуватися із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла для підвищення резистентності організму тварин і стимуляції післявакцинального імунітету.
Вивчення імуногенності вакцини живої культуральної проти вірусної діареї на телятах. Імуногенність вакцини живої культуральної з атенуйованого штаму ВК‑1М вірусу діареї вивчали на телятах у неблагополучному щодо вірусної діареї дослідному господарстві «Українка Слобідська» згідно з наказом директора ІЕКВМ УААН № 7-б від 20 січня 2004 року.
Випробування запропонованої вакцини здійснювали за методикою, що була розглянута й схвалена методичною комісією ІЕКВМ УААН (протокол № 1 від 2 лютого 2004 року), згідно з якою в господарстві було сформовано 5 груп телят 3–4-місячного віку (по 5 голів у кожній). До застосування вакцини в телят усіх дослідних груп виявлені специфічні до вірусу діареї антитіла в титрах від 3,5 до 4,5 log2 (рис. 1).
Першій групі телят вакцину щепили внутрішньом’язово дворазово з інтервалом у 14 діб у дозі 2Ч105,45 ТЦД50/гол., а другій – 5Ч105,45ТЦД50/гол., що відповідно містились у щепних об’ємах 2 і 5 см3. Телятам третьої групи вакцина в дозі 2Ч105,45 ТЦД50/гол. була введена одночасно з ЛПС-1 із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварин. Телята четвертої групи отримували лише ЛПС-1 у дозі 7 мкг/кг маси тіла. П’ята група телят була контрольною, якій ні вакцина, ні ліпополісахарид не щепили. Отримані дані свідчать про те, що вакцина позитивно впливала на динаміку імунної відповіді незалежно від вихідної серопозитивності телят до її застосування.