Гидроксил радикал отнимает притон от -CH(R)- группы белка, образую воду (реакции a и b). Образовавшийся алкил радикал может либо связаться со вторым алкил радикалом (реакция р), либо прореагировать с кислородом, образовав алкил пероксид радикал (реакция с). Далее алкил пероксид радикал, присоединяя протон, образует алкил пероксид. Протон он получает реагируя либо с Fe2+ (реакция g), либо с пероксильным радикалом (НО2*) (реакция f). Алкил пероксид белка может реагировать с таким же пероксидом (дисмутация), высвобождая кислоров и образуя алкокси белок (реакция о). Алкокси белок может также образовываться путем восстановления алкил пероксида либо Fe2+ (реакция g), либо пероксильным радикалом (НО2*) (реакция f).
Рисунок 30: Окисление белков по α-амидному и диамидному путям.
Дальнейшее преобразование алкокси белока может пойти двумя альтернативными путями:
- α-амидный путь: алкокси белок может преобразовываться в гиброксильную производную (реакция i, j), пептидня связь которой подвергается в дальнейшем расщеплению (реакция k, l),
- диамидный путь (реакция m).
В итоге исходный белок разделяется на более мелкие пептиды, что приводит к его дисфункции.
АФК значительно влияют на концентрации ионов кальция в матриксе и цитоплазме, провоцируя закачку Са2+ в цитоплазму из внеклеточного пространства и внутриклеточных депо, а в матрикс из цитоплазмы, путем активации кальциевых транспортеров [51].
Еще одно уязвимое место дыхательной цепи - Q-цикл. В двух Q-связывающих сайтах комплекса III происходит генерация убисемихинон анион радикала. Убисемихинон, образовавшийся в Qp сайте, способен реагировать с молекулярным кислородом с образованием убихинона и супероксида:
UQ.– + O2 → UQ + O2.– .
В сайте QN активное взаимодействие радикала с кислородом не наблюдается из-за хорошей стабилизации радикала и его глубокого относительно толщи мембраны расположения, так, что кислороду трудновато до него добраться.
При связывании антимицина А с сайтом QN окисление убисемихинона в сайте Qp предотвращается, увеличивается его время существования, что повышает вероятность формирования O2.–. Супероксид инициирует цепной процесс автоокисления коэнзима, легко окисляя его с образованием новых молекул убисемихинона. Таким образом, одним из главных источников активных форм кислорода в митохондриях является Q-цикл.
Замечательное свойство убисемихинон состоит в том, что образующийся молекулы убисемихинон легко включается в Q-цикл, при этом легко и быстро регенерируя убихинол в ходе постоянно идущего естественного процесса транспорта электронов в дыхательной цепи. Убихинол, свою очередь, проявляет ярко выраженные свойства антиоксиданта, предотвращая перекисное окисление мембранных липидов (см. выше) [35]. Убихинол достаточно эффективно обрывает цепной процесс образования перекос-ных радикалов, превращаясь в убисемихинон, который затем может реагировать с новы-ми липидными радикалами, а также диспропорционировать с образованием UQ и UQH2:
UQH2 + L . / LOO . → UQH .+ LH / LOOH
UQH . + L . / LOO . → UQ + LH / LOOH
UQH . + UQH . → UQ + UQH2
В любом случае, образующиеся формы CoQ способны включаться в Q-цикл, и тем самым антиоксидант убихинол постоянно регенерируется.
Кроме явного проявления антиоксидантных свойств путем непосредственного взаимодействия с АФК, убихинол принимает еще и опосредованное, неявное участие в борьбе с клеточными вредителями. Убихинол восстанавливает другой важнейший жирорастворимый антиоксидант – витамина Е: убихинол взаимодействует с α-токофероксил радикалом с образованием убисемихинон радикала, который регенерируется за счет взаимодействия с другими радикалами или включения в Q-цикл дыхательной цепи (рис. 31).
Замечательно то, что антиоксидант убихинол, принимая на себя удар, может регенерироваться, вступая своей окисленной формой в Q-цикл, быстро восстанавливаясь в ходе постоянно идущего естественного процесса транспорта электронов в дыхательной цепи.
В ряде работ также показано участие UQH2 в предотвращении окисления мембранных белков и ДНК [37]. Митохондриальная ДНК является еще одной мишенью для АФК. Высокая концентрация активных форм кислорода в митохондриях и слабая система репарации увеличивают частоту мутаций мтДНК по сравнению с ядерной на порядок. Радикалы кислорода служат причиной специфических замен Ц®Т (дезаминирование цитозина) и Г®Т (окислительное повреждение гуанина), вследствие чего, возможно, мтДНК богаты АТ-парами. Повреждение мтДНК особенно опасно в связи с постепенным накоплением мутаций, длительным эффектом АФК. В митохондриальном геноме закодирован ряд важнейших уникальных митохондриальных белков и повреждение ответственных за них генов приводит к нарушениям в их экспрессии и последующем функционировании. Прослеживается четкая корреляция между возрастом и накоплением мутаций в мтДНК, падением эффективности дыхания и увеличением продукции АФК, что легло в основу митохондриальной теории старения [53].
Рисунок 31: Про-оксидативные и антиоксидантные свойства кофермента Q [37].
Аналоги убихинона.
Таким образом, коэнзим Q является антиоксидантом клетки. Многие заболевания и общее старение организма связано с тем, что митохондрии не справляются с детоксикацией АФК. Поэтому изучение и возможное терапевтическое применение антиоксидантов (в частности, CoQ и его аналогов) представляет очень большой интерес. Можно попытаться распознать функцию CoQ, изменяя содержание CoQ внутри митохондрий, но для повышения концентрации CoQ в митохондрии необходимо адресовано ввести кофермент в изолированные митохондрии, клетки или же организмы. Вследствие гидрофобности и соответственно низкой растворимости в водной среде возникает проблема доставки CoQ и, следовательно, и его изучения in vitro.
Для повышения концентрации аналогов хинонов, животным в течение нескольких недель дают пищу обогащенную хинонами, так что во всех тканях устанавливается стабильная необходимая для исследований концентрация. Эти соединения могут с помощью кровотока равномерно распределяться в тканях; так их активные формы были обнаружены в наиболее подверженных окислительному стрессу тканях, то есть в мозге, печени, сердце и мышцах животных. При этом концентрация аналогов хинонов в митохондриях в несколько сот раз выше, чем в кровотоке. Аналоги хинонов при необходимости легко выводятся из тканей, возвращаясь опять в кровь и достаточно быстро экскрегируются из организма при отмене диеты.
Гидрофобность коэнзима определяется в первую очередь его боковой изопреноидной цепью. Менее гидрофобные, но по-прежнему активные производные CoQ могут быть получены путем замены длинной боковой цепи на более водорастворимые «хвосты». Такие производные CoQ широко используются в качестве электронных доноров и акцепторов при изучении ферментов и для повышения содержания коэнзима в митохондриях и клетках. Биологическая активность подобных искусственно синтезированных аналогов CoQ должна в значительной степени сохраняться, так как в передаче электронов участвует бензохиноновое кольцо, а боковая цепь выполняет только функцию заякоривания молекулы в мембране.
Как правило, такие производные (рис. 32) имеют либо очень короткую боковую цепь из одной - двух изопреноидных звеньев в позиции 6 (коэнзимы Q1, Q2), либо более простую алифатическую боковую цепь без разветвлений (децилубихинон) или модифицированную гидроксилом или другой гидрофильной группой (например 10-гидроксидецил в идебеноне) [75]. В любом случае, даже подобные аналоги CoQ все еще достаточно гидрофобны, и, при попытке их введения в биологические системы, неспецифично включаются во все фосфолипидные бислои, и только маленькая часть попадает в митохондриальные мембраны.
Для адресной доставки коэнзима Q в митохондрии перспективно использование конъюгатов с так называемыми липофильными катионами, в том числе с трифенилфосфонием.
Так, аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами трифенилфосфония, образуют ряд молекул (рис.34):
- MitoQ (mitochondria-targeted ubiquinone)-производное хинона, ковалентно связанное с катионом алкилТРР; MitoQ10 -хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце.
- Mito Vit Q (mitochondria-targeted derivative of α-tocoferol),
- spin traps (Mito PBN, mitochondria-targeted derivative of the spin trap phenylbutylnitrone),
- TBTP, IBTP (тиоловые зонды),
- MitoDC81 (DNA alkylating reagent).
Еще в 1969 году Скулачевым и коллегами было показано потенциал-зависимое накопление дибензиламмония в митохондриальном матриксе, что дало толчок к изучению накопления липофильных катионов энергизованными митохондриями [72]. Накопление дибензиламмония было весьма слабым и требовало наличия противоиона, в качестве которого использовался липофильный анион тетрафенилборат. В дальнейших исследованиях использовался другой катион– метилтрифенилфосфоний, который не нуждается в противоионе. Таким образом, катионы трифенилфосфония (ТРР) стали применяться в качестве зондов при изучении функций митохондрий.
Рисунок 32: производные коэнзима Q