Участие аналогов убихинона в переносе электронов в дыхательной цепи митохондрий (стр. 6 из 12)
Помимо двух основных наиболее стабильных форм, кофермент Q имеет еще и другие короткоживущие нестабильные протонированные и окисленные формы, участвующии в процессах последовательного одноэлектронного переноса электронов в клетке (рис. 16)
Так, в реакции окисления UQH2 до UQH2+ убихинол представляет собой весьма слабый восстановитель (> 850 мВ), тогда как образующийся при потере протона анион UQH– (1) уже более активен (~190 мВ), и может отдать электрон мягким клеточным окислителям (2). Получившийся убисемихинон-радикал UQH* отдает второй протон (3), образуя убисемихинон радикал анион UQ–, который является сильным восстановителем (j~ -240 ¸ -230 мВ); последний отдает электрон и превращается в убихинон UQ (4).
Обратная реакция восстановления убихинона до анионной формы радикала может быть осуществлена только сильными восстановителями (5), при этом последующая стадия образования аниона UQ2- проходит легко (6). Анион же, в свою очередь, присоединением двух протонов превращается в убихинол. В данном случае в ходе восстановления убихинона происходит последовательное присоединение сразу двух электронов, тогда как при окислении убихинола перенос электронов разделен акцептированием протонов.
Содержание CoQ в митохондриях различных тканей неодинаково (1-4.5 нмоль CoQ на мг белка (у грызунов)). Так больше всего CoQ на мг белка приходиться на клетки сердечной и скелетных мышц, а на клетки мозга и печени приходиться всего 1 нмоль CoQ на мг белка. Кофермент Q свободно перемещается в билипидном слое внутренней мембраны. Изопреноидный хвост располагается в центре бислоя параллельно поверхности, заякоривая молекулу внутри мембраны. Бензохиноновое кольцо также погружено в мембрану, но способно менять свою пространственную ориентацию, тем самым, обеспечивая перенос электронов: кольцо может располагаться как в середине бислоя параллельно поверхности, так и вдоль ацильных цепей перпендикулярно поверхности, но не ближе1-2 нм к поверхности. Таким образом, CoQ не взаимодействует с растворенными в матриксе восстановителями типа глутатиона и аскорбата.
Рисунок 16: Редокс-формы СoQ и их взаимопревращения
Для гомологов CoQ c достаточно длинной боковой цепью молекулярная динамика и минимизация энергии показали свернутую структуру молекулы: последняя изопреноидная единица находится в тесном контакте с бензохиноновым кольцом. То же показано для анионных и радикальных интермедиатов с помощью EPR [9].
Таким образом, убихинон объединяет в себе свойства донора двух электронов и акцептора одного электрона, подобно другим важным переносчикам в цепи - флавопротеинам [35].
Вообще перенос восстановительных эквивалентов представляет собой векторный процесс, в результате которого создается ΔμH. К дегидрогеназам, принимающим восстановительные эквиваленты от различных субстратов и переносящим их на СоQ, относятся: комплекс I (НАДН -убихинон оксидоредуктаза – входит в состав), комплекс II (сукцинатдегидрогеназа), дигидрооротат дегидрогеназа, глицерол-3-фосфат дегидрогеназа, а также ряд растительных и дрожжевых НАДН-дегидрогеназ, не участвующих в создании протонного градиента. Эти ферментативные комплексы восстанавливают убихинон до убихинола, а он, в свою очередь, окисляется комплексом III (в клетках млекопитающих) или рядом альтернативных оксидаз (дрожжи, растения). Комплекс III осуществляет векторный транспорт электронов от убихинола к цитохрому с.
Комплекс III (комплекс bc1 или убихинол цитохром с оксидоредуктаза)
Комплекс III представляет собой димер из двух идентичных мономеров, состоящих из 11 белковых субъединиц. Функциональное ядро каждого мономера состоит из трех субъединиц: цитохрома b (содержит два гема bh(566) и bl(562)), белка Риске с железосерными кластерами 2Fe-2S и цитохрома с1 с одним гемом с (рис 17).
Рисунок 17: Функциональное ядро комплекса III.
Цитохром b – белок массой около 45 кДа - погружен в мембрану и состоит из 9 α-спиралей, 8 из которых пересекают мембрану (трансмембранные). Это полипептид кодируется мтДНК. Цитохром b (рис. 20) содержит два гемма - bh и bl, которые расположены между 2ой и 5ой α-спиральными колоннами и связаны с белком по крайней мере тремя связями. Две из них образуются имидазольными группами остатков гистидина белка и железом гемма, а третья – положительно заряженной группой остатков аргинина или лизина белка и отрицательно заряженной пропионатной группой гемма. Гемм bl, расположен ближе к межмембранному пространству, а bh - ближе к цитозолю (рис. 19).
FeSIII белок (белок Риске или фактор Слейтера) – полипептид массой 21,5 кДа (состоит из 199 аминокислот), который содержит один 2Fe-2S кластер (рис. 12). BAL и Zn сильно тормозят перенос электронов с Fe-2 кластера на цитохром с.
Цитохром с1,белок массой 28 кДа, содержит один гем с (рис. 19), который вместе с железо-серным белком комплекса III образует место связывания с цитохром с на обращенной в межмембранное пространство стороне внутренней мембраны.
В комплексе bc1 есть два сайта взаимодействия с коэнзимом Q - QN и Qp (рис. 17). Субъединицы комплекса III взаимодействуют между собой с образованием двух «карманов», где и происходят реакции Q-цикла. Сайт QN находится ближе к обращенной к матриксу стороне мембраны (сторона N), и именно с ним связывается ингибитор дыхания антимицин А, блокируя перенос электрона с гема bh на убихинон. Сайт Qp находится ближе к межмембранному пространству (сторона Р), и с ним связывается другой ингибитор– миксотиазол, блокируя перенос электрона с убихинола на железосерный кластер.
Общее соотношение UQH2/UQ в CoQ пуле определяется интенсивностью дыхания клетки. В состоянии 4, когда митохондрия не синтезирует АТФ, уровень дыхания низкий, и пул CoQ относительно восстановлен. В состоянии же 3, когда происходит активный синтез АТФ, дыхание идет быстро, приводя к окислению пула CoQ. В изолированных митохондриях доля восстановленной формы в случае низкой интенсивности дыхания составляет 75-90%, а в случае высокой– 50-60% (молекула CoQ изменяет свой редокс-статус каждые 50 мсек) [35]. Ингибирование комплексов III и IV и добавление субстратов для комплекса I или II сдвигает соотношение UQH2/UQ в сторону восстановленной формы, и наоборот.
В ходе Q-цикла две молекулы UQH2 окисляются в Р-сайте, высвобождая в межмембранное пространство по два протона на каждую молекулу; один электрон от каждой молекулы UQH2 идет на цитохром с1, а второй– на расположенную в N-сайте молекулу UQ через гемы цитохрома b. Таким образом, принимая последовательно два электрона от двух молекул UQH2 и два протона, одна молекула UQ восстанавливается, при этом промежуточным интермедиатом является убисемихинон анион радикал:
UQH2 +UQ′ + Сyt c1 (ox) → UQ′.– + 2H+p + Сyt 1(red) + UQ,
UQH2 + UQ′.– + 2H+N + Сyt c1 (ox) → UQH′2 + UQ + 2H+p + Сyt с1(red)
Несмотря на сложность процесса, результирующая реакция проста, и отражает перенос электронов с убихинола на цитохром c1 и транспорт протонов через мембрану:
UQH2 + 2 Сyt c1 (ox) + 2H+N → Q + 2 Сyt c1(red) + 4H+p .
В ходе данного процесса происходит миграция молекул CoQ в толще мембранного бислоя между сайтами Qp и QN и образование в этих сайтах убисемихинон радикалов.
С цитохрома c1 электрон передается на цитохром с, который восстанавливает цитохромоксидазу.
Цитохром с является относительно небольшим (масса 12кДа, состоит из 104 аминокислот) водорастворимым белком, локализованным на межмембранной поверхности внутренней митохондриальной мембраны. Он содержит гемм с (рис. 19), ковалентно связанный с апобелком. Цитохрома c совершает челночные движения между цитохромом c1 и цитохромоксидазой, перемещаясь вдоль поверхности мембраны. Кардиолипин участвует в связывании цитохрома с с мембраной.
Комплекс IV (цитохромоксидаза).
Это последний комплекс дыхательной цепи, передающий электроны от цитохрома с на молекулярный кислород, окисляя его до Н2О. Цитохромоксидаза - это большой фермент (масса 240 кДа) внутренней мембраны митохондрий, состоящий из 13 субъединиц у млекопитающих, и 3 или 4 - у бактерий. Функциональное ядро содержит четыре редокс-центра: два гемма а-типа (гемм а и гемм а3) (рис. 20) и два атома меди (CuA и CuB) (рис.21).
10 регуляторных субъединиц комплекса кодируются ядерным геномом и синтезируются в цитоплазме: IV (17 кДа), V (12,5 кДа), VIa (10,5 кДа), VIb (9,5 кДа), VIc (8,5 кДа), VII (10 кДа), VIIIa (5,5 кДа), VIIIb (5 кДа), VIIIc (6 кДа).
Рисунок 21: Комплекс IV.
Три субъединицы этого комплекса кодируются митохондриальным геномом. Субъединица III (30 кДа) 7 раз пересекает мембрану. Субъединица II (26 кДа) содержит CuA-центр, состоящий из двух ионов Cu в комплексе с –SH группами двух Cys (похож на 2Fe-2S-центр). Кроме того, в субъединице II находятся две гидрофобные последовательности, два раза пересекающие мембрану. Субъединица I (57 кДа) содержит остальные редокс-центры, как-то: две группы геммов а и а3 и CuB-центр. Гемм а3 и CuB формируют второй двуядерный центр, который принимает электроны с гемма а и передает их на О2, связанный с геммом а3. Таким образом, электрон с цитохрома с передается на CuA-центр, далее на гемм а, а после на гемм а3 - CuB –центр. С CuB –а3 – центра электрон переноситься на кислород. Ингибиторами этой реакции являются KCN, CO, H2S и азид.