На підставі отриманих результатів досліджень щодо вибору чутливої тест-системи для ролерного культивування та вивчення репродуктивної активності випробуваних штамів вірусу діареї встановлено, що за цими показниками штам ВК‑1М вірусу діареї ВРХ відповідає вимогам до інфекційності виробничого штаму, призначеного для виготовлення вакцини (табл. 1).
Зокрема, оптимальною є доза зараження моношарової культури клітин КСТ як у матрасах, так і в бутлях у співвідношенні 1:20 і 1:30 об’єму вірусу з титром інфекційності 1000 ТЦД50/см3 і підтримуючого поживного середовища, що відповідає інфекційності вірусу 0,01 ТЦД50/клітину, яка забезпечує максимальну репродукцію штаму ВК-1М ВД упродовж 40 годин із кінцевими титрами 6,6 і 7,6 lg ТЦД50/см3 відповідно.
Таблиця 1
Властивості виробничого штаму ВК–1М ВД
| Показники | Необхідні параметри | ||
| матраси | бутлі | ||
| Оптимальна доза зараження | співвідношення об’єму вірусу й підтримуючого середовища | 1:20 | 1:30 |
| Інфекційна активність вірусу в заражаючій дозі | ТЦД 50/см3 | 1000 | 1000 |
| Множинність зараження | ТЦД50/клітину | 0,01 | 0,01 |
| Час репродукції в моношаровій культурі клітин КСТ за ролерного культивування | годин | 40 | 40 |
| Титр інфекційності вихідної сировини | lg ТЦД 50/см3 | 6,6 | 7,6 |
Після відпрацювання технології культивування й накопичення біомаси вірусу діареї ми здійснили дослідження щодо її звільнення від клітинного детриту.
Як засвідчили результати цих досліджень, виконаних на моделі штаму ВК–1М вірусу діареї, осадження клітинного детриту за методом спонтанної седиментації й центрифугування за 2500 g упродовж 30–ти хвилин забезпечувало відповідно отримання прозорої вірусовміщуючої рідини на 34–35 і 44–45 % порівняно з дистильованою водою (табл. 2).
У той же час очистка не впливала на інфекційну активність вірусу, яка залишалася фактично на одному рівні як до, так і після видалення клітинного детриту шляхом седиментації та центрифугування, й становила відповідно 7,55 і 7,6 lg ТЦД 50/см3.
Таблиця 2
Порівняльна оцінка способів очистки вірусу діареї M±n, n=3
| Спосіб очистки | Ступінь очистки за прозорістю,% | Кількість білка, мкг/см3 | Титр інфекційності, lg ТЦД50/см3 | ||
| до очистки | після очистки | до очистки | після очистки | ||
| Седиментація | 34–35 | 2185 | 1845 | 7,60±0,15 | 7,55±0,25 |
| Центрифугування | 44–45 | 2185 | 1148 | 7,60±0,15 | 7,60±0,10 |
Однак отримані дані свідчать про те, що центрифугування за 2500 g протягом 30‑ти хвилин сприяє більш швидкому та ефективному очищенню вірусовмісної суспензії від клітинного детриту й загального білка, на підставі чого в подальшому застосовували цей метод під час виготовлення дослідних зразків живої вакцини проти вірусної діареї, хоча цей спосіб є більш затратним порівняно із седиментацією, що впливає на собівартість препарату.
Вивчення антигенних властивостей виробничого штаму ВК–1М вірусу діареї. Відомо, що в процесі конструювання вакцинних препаратів на основі атенуйованих штамів вірусу важливим є визначення їхніх антигенних властивостей. Здатність атенуйованого штаму ВК-1М вірусу діареї, обраного нами як виробничий, індукувати в організмі тварин вірусоспецифічні антитіла вивчалась у порівняльному аспекті із штамами 25 і Oregon C 24 V як можливими компонентами для створення вакцини. Дослід здійснено на кроликах, які були сформовані в групи по 5 голів з розрахунку на штам вірусу діареї, який вводили одноразово внутрішньом’язово у відповідній дозі, а саме: Oregon C 24 V – 2Ч105,7 і 2Ч107 ТЦД50/гол., 25 – 2Ч105,7 і 2Ч107 ТЦД50/гол. і ВК-1М – 2Ч106,6 і 2Ч107,6 ТЦД50/гол. відповідно першого та п’ятого їх пасажів у культурі клітин.
Установлено, що як у першому, так і в п’ятому пасажах у культурі перещеплюваних клітин КСТ досліджувані штами зберігають здатність індукувати в організмі кроликів вірусонейтралізуючі антитіла, які виявлялися вже на 7 добу після введення та фактично утримувалися на одному рівні до 14 доби (термін спостереження) у титрах 6,0–6,7 lоg2 і 6,3–6,8 lоg2. Отримані дані свідчать про антигенну стабільність досліджуваних штамів, зокрема атенуйованого штаму ВК‑1М, як у процесі адаптації до нових умов культивування, так і в пасажах у перещеплюваній культурі клітин КСТ.
Конструювання живої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби. Для виготовлення вакцини використовували культуральну суспензію, отриману в результаті репродукції штаму ВК–1М вірусу діареї в моношаровій культурі клітин КСТ, вирощеній у ролерних 3-літрових бутлях. Після одноразового заморожування – відтавання вірусовміщуючу суспензію центрифугували 30 хвилин за 2500 g для видалення клітинного детриту й визначали інфекційний титр шляхом зараження моношарової культури клітин десятикратними розведеннями вірусу. Титр інфекційної активності вірусу в цій культурі був на рівні 7,6 ± 0,1 lg ТЦД50/см3.
Нами було виготовлено два дослідних зразки вакцини, один з яких був висушений методом ліофілізації в умовах ННЦ «ІЕКВМ». У процесі виготовлення ліофілізованого зразка вакцини використовували захисне середовище, яке готували з рівних об’ємів 50 % сахарози і 25 % желатину, після змішування яких із вірусовміщуючою культуральною суспензією у співвідношенні 1:9 кінцева концентрація становила 5,6 % і 2,8 %, відповідно. Під час вивчення інфекційної активності встановлено, що в процесі ліофілізації вона зменшувалася на 2,15 lg ТЦД50/см3 порівняно з вихідним показником (табл. 3). Проте антигенна активність вірусу не змінювалася. Титри вірусонейтралізуючих антитіл у пробах сироватки крові, відібраної у кроликів через 7 і 14 діб після щеплення досліджуваних зразків рідкої та сухої вакцин, були фактично однаковими (6,5 ± 0,2 і 6,3 ± 0,3 log2).
Таблиця 3
Вплив ліофілізації вакцини на інфекційність та антигенну активність вакцинного вірусу діареїn=3
| Зразок вакцини | Титр інфекційності, lg ТЦД50/см3 | Титр ВН-антитіл, log2(М±м) | |
| 7 діб | 14 діб | ||
| Рідка (нативна) | 7,6±0,1 | 6,2±0,1 | 6,5±0,2 |
| Ліофілізована | 5,45±0,3 | 6,0±0,2 | 6,3±0,3 |
Вивчення вакцини за показниками якості. Кожний зразок вакцини (рідкої і сухої) проти ВД ВРХ перевіряли на контамінацію сторонніми мікроорганізмами, нешкідливість, антигенну та імуногенну активність. Контроль на контамінацію бактеріями та грибами здійснювали відповідно до ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод контроля стерильности» та згідно з ДСТУ 4483:2005 «Препарати ветеринарні імунобіологічні. Методи визначення бактеріальної і грибкової контамінації». Проростів у вигляді помутніння, змін кольору або газоутворення в інокульованих бактеріологічних середовищах не спостерігали у всіх трьох послідовних пасажах досліджуваних проб, що свідчило про відсутність забрудненості бактеріями й грибами. Контамінацію досліджуваних зразків вакцини мікоплазмами виключали за результатами висівів у середовище Едварда. У трьох послідовних пересівах кожного зразка вакцини в напіврідкому агарі не виявлено завислих, напівпрозорих, у вигляді крапель, а на напівтвердому агарі - росту випуклих соскоподібних колоній мікоплазм.
З урахуванням вимог Європейських стандартів здійснювали контроль вакцини на контамінацію сторонніми вірусами. Відсутність ЦПД у моношаровій культурі клітин у трьох послідовних пасажах суміші вірусу діареї й специфічної сироватки крові вказувало на те, що дослідні зразки були вільними від сторонніх цитопатогенних вірусів.
Нецитопатогенні віруси визначали за методом гемадсорбції. У жодному випадку не спостерігали адсорбцію еритроцитів морської свинки на моношарі клітин, які попередньо інокулювали сумішшю вакцини й специфічної до вірусу діареї сироватки крові.
Отже, розроблена технологія забезпечувала накопичення вихідної вірусовміщуючої культуральної суспензії з високою інфекційністю та виготовлення сухої форми вакцини, не контамінованих сторонніми мікроорганізмами.
Вивчення реактогенності вакцини. Реактогенність виготовлених зразків вакцини проти вірусної діареї, виготовлених із штаму ВК-1М, вивчали в дослідах на кроликах. Зразки середніх проб рідкої та сухої культуральної вакцин вводили підшкірно в об’ємі 2 мл, що відповідало 2Ч107,6 і 2Ч105,45 ТЦД50/гол., дворазово з інтервалом у 14 діб. У кроликів, щеплених сухим зразком вакцини із штаму ВК-1М і вірусовміщуючою культуральною суспензією штамів 25, Oregon C 24 V, не спостерігали відхилень від нормального клініко-фізіологічного стану, температура тіла була в межах норми.
За результатами гематологічних досліджень у тварин, яким вводили культуральну суспензію штамів 25 і Oregon C 24 V, установлено деяке зниження кількості лейкоцитів у межах 0,5–0,6 тисяч/мм3, а починаючи від 14 доби вона поступово поновлювалась і на 24 добу після щеплення сухої вакцини чи то вірусовміщуючої суспензії досліджуваних штамів 25 і Oregon C 24 V досягала вихідних показників.
Збільшення кількості нейтрофілів супроводжувалося підсиленням фагоцитарної реакції у кроликів у перші доби і її зменшенням та послабленням фагоцитарної реакції на 7–14 доби після щеплення сухого зразка вакцини із штаму ВК–1М і вірусовміщуючої культуральної суспензії штамів 25 і Oregon C 24 V.