Розробка живої культуральної вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби (стр. 5 из 7)

Рис. 1. Динаміка специфічних антитіл у телят, щеплених вакциною проти вірусної діареї в комплексі з ЛПС-1

Інтенсивність приросту титрів специфічних до вакцинного вірусу антитіл у телят залежала від щепної дози. Так, на 7 добу після введення вакцини в дозах 2 і 5 см³/гол. їх титр зростав на 1,75 і 2,0 log₂ відповідно, а на 28 добу він був вищим на 2,8 і 3,75 log₂ порівняно з вихідним (3,5 і 4,0 log₂).

Застосування ліпополісахариду суттєво підсилювало приріст титру антитіл за одночасного щеплення вакцини в дозі 2Ч10^5,45ТЦД₅₀/гол. у середньому на 2,0 log₂ відносно титрів антитіл у разі застосування однієї вакцини в цій дозі. Перевагу застосування вакцини в комплексі з ЛПС-1 підтверджено також стабільним утриманням високого рівня титру специфічних антитіл упродовж 60 діб з поступовим зниженням його до 7,5±0,23 log₂ на 180 добу, а також даними щодо титру нейтралізуючих антитіл у разі застосування однієї вакцини в дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., де він був у середньому на 1,5 log₂ нижчим.

У разі щеплення вакцини в комплексі з ЛПС-1 у сироватці крові телят збільшувався вміст загального білка, імуноглобулінів класів М і G, циркулюючих імунних комплексів, що свідчить про посилення показників неспецифічної резистентності.

Важливим моментом у виборі щепної дози вакцини було дослідження концентрації серомукоїдів, підвищення рівня яких було виявлено вже на 3 добу в телят, яким щепили препарат у дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., і майже в 3,5 рази на 14 добу після першого щеплення.

Підвищення рівня серомукоїдів свідчить про виражену імуносупресивну дію вакцини живої в дозі 5 см³ (5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол.) на клітинну ланку імунітету, що збігається з даними F. A. Roth et al. (1983, 1986) і вказує на недоцільність застосування живої вакцини в такій дозі.

Отже, за результатами цього досліду встановлено, що випробувана вакцина проти вірусної діареї у разі введення телятам як окремо в дозах 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. і 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол., так і в меншій дозі одночасно з ЛПС‑1 виявляє виражені імуногенні властивості. Вакцина, введена в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. (2 см³) у комплексі з ЛПС‑1, викликає індукцію вірусонейтралізуючих антитіл у середньому на 2,0 log₂ вище порівняно з їх титрами, які виявляються під час застосування однієї вакцини в такій же дозі. Щеплення вакцини в комплексі з ЛПС‑1 позитивно впливає на всі ланки імунітету, в тому числі й неспецифічного. У той же час у разі застосування вакцини в дозі 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. виявляється імуносупресивний ефект, що свідчить про недоцільність її введення телятам у цій дозі. Одночасне щеплення ЛПС‑1 з вакциною в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. стимулює біосинтез факторів специфічної й неспецифічної резистентності, що свідчить про імуномодулюючу дію застосовуваного ліпополісахариду.

Вивчення профілактичної ефективності вакцини живої культуральної проти вірусної діареї у виробничих умовах. Виробниче комісійне випробування профілактичної ефективності вакцини здійснено в неблагополучному щодо вірусної діареї господарстві на 72 телятах 21–28-добового та 3–4-місячного віку, з яких були сформовані по 3 групи по 12 тварин у кожній. У досліді використали експериментальну серію вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та імуномодулятор ЛПС-1, виготовлений з культури Bacіllus alvei, що були заздалегідь перевірені на стерильність та нешкідливість для тварин. Ліофілізований зразок вакцини мав інфекційність на рівні 5,45 lg ТЦД₅₀/см³.

У процесі вивчення динаміки імунітету встановлено, що в телят як перших (21–28-добового і 3–4-місячного віку), так і других груп, котрим щепили відповідно одну вакцину в дозі 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀/гол. і вакцину в цій дозі в комплексі з ЛПС‑1 із розрахунку 7 мкг/кг маси тіла тварин, вже на 7 добу було виявлено зростання титру вірусонейтралізуючих антитіл до 3,2 і 4,3 log₂. Причому, титр вірусонейтралізуючих антитіл у телят 21–28-добового віку, котрим вакцину щепили в комплексі з ЛПС‑1, був вищим на 0,9 log₂ порівняно з введенням однієї вакцини. Після другого введення цих препаратів титр антитіл стабілізувався на рівні 6,4–8,0 log₂ і утримувався до 60 доби, після чого дещо знижувався до 5,3–7,1 log₂ на 180 добу.

У процесі щоденного клінічного нагляду та термометрії телят протягом перших 14 діб не було виявлено погіршення загального стану тварин, а також підвищення температури тіла. У подальшому не встановлено хворих тварин серед щеплених як однією вакциною, так і вакциною в комплексі з ЛПС-1, у той час як у контрольних групах телята перехворіли з ознаками ураження очей (гіперемія кон’юнктиви, сльозотеча) та слизової оболонки верхніх дихальних шляхів (слизовитікання з носа, кашель), а також підвищенням на 1,0–1,5 °С температури тіла, що спостерігались упродовж 2–3 тижнів, після чого клінічні ознаки поступово згасали. Температурна реакція була нестабільною, частіше реєструвалася надвечір протягом 7–12 діб. Клінічні ознаки були більш вираженими в телят молодшого віку.

Отже, результати комісійного випробування вакцини живої культуральної проти вірусної діареї великої рогатої худоби на телятах у виробничих умовах надали підставу вважати, що вона відповідає вимогам ТУУ за відсутністю контамінації сторонніми мікроорганізмами, високою антигенною активністю та здатністю індукувати імунітет в організмі щеплених нею телят, захищає їх від проявів клінічних ознак хвороби.

За результатами комісійного виробничого випробування вакцина жива культуральна проти вірусної діареї була рекомендована для впровадження в біофабричне виробництво та застосування для профілактики вірусної діареї у неблагополучних щодо цієї хвороби господарствах.

На підставі отриманих даних ми пропонуємо спосіб профілактики вірусної діареї ВРХ у неблагополучних господарствах шляхом застосування живої вакцини з атенуйованого вірусу штаму ВК–1М і ліпополісахариду з Bacillus alvei (ЛПС–1).

За результатами здійснених досліджень розроблено нормативну документацію на вакцину живу культуральну проти вірусної діареї великої рогатої худоби (інструкція з виготовлення й контролю якості, ТУУ та настанова із застосування), в подальшому розглянуту і схвалену методичною комісією ІЕКВМ УААН (протокол № 16 від 8 грудня 2004 р.) і подану на експертизу до ДНКІБШМ та узгодження до Державного департаменту ветеринарної медицини України.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації подано експериментальне й практичне вирішення проблеми специфічної профілактики вірусної діареї великої рогатої худоби, а саме: створено живу культуральну вакцину та розроблено технологію її виготовлення. За результатами досліджень щодо вивчення тест-об’єкту для культивування вірусу діареї, його інфекційності, антигенних та імуногенних властивостей обрано клітинну систему і виробничий штам вірусу для напрацювання вихідної сировини з метою виготовлення вакцини. Створено препаративну форму вакцини живої культуральної проти вірусної діареї, обґрунтовано формування й корекцію післявакцинального імунітету, запропоновано комплексне застосування вакцини та імуномодулятора з бактеріального ліпополісахариду.

2. Розроблено живу культуральну вакцину проти вірусної діареї великої рогатої худоби з модифікованого штаму ВК-1М вірусу діареї, репродукованого в ролерній моношаровій культурі перещеплюваних клітин КСТ, з інфекційністю 5,45 lg ТЦД₅₀/см³, яку стабілізовано в процесі ліофілізації за допомогою 5,6 %‑ї сахарози і 2,8 %-го желатину (кінцеві концентрації). Вакцина не контамінована сторонніми мікроорганізмами, нешкідлива для тварин, слабореактогенна, призначена для щеплення великої рогатої худоби в неблагополучних господарствах.

3. Перещеплювані культури клітин ТрТ, ВНК-21/13 та КСТ мають високу проліферативну активність у процесі вирощування в суміші з рівних об’ємів поживних середовищ 199 та Ігла і 10 % нормальної сироватки крові великої рогатої худоби. Посівна концентрація з розрахунку 300 тисяч клітин/см³ поживного середовища забезпечує відповідно в 2,6; 4,8 і 4,9 рази вищий їх приріст за ролерного способу культивування, який скорочує на 20–48 годин термін накопичення біомаси клітин для напрацювання вихідної для виготовлення вакцини вірусної сировини порівняно зі стаціонарним у матрасах.

4. Виробничий штам ВК-1М вірусу діареї, адаптований до розмноження в культурі перещеплюваних клітин у ролерних бутлях, зберігає активну репродуктивну здатність і має високу інфекційність. Оптимальний час репродукції та титр його інфекційності становить у культурі перещеплюваних клітин ТрТ відповідно 46 годин і 7,05 lg ТЦД₅₀/см³, ВНК-21/13 – 64 години і 7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Більш придатною для репродукції та накопичення біомаси штаму ВК-1М є перещеплювана культура КСТ, яка забезпечує його репродукцію впродовж 40 годин з інфекційністю 7,6 lg ТЦД₅₀/см³.

5. Щеплення вакцини живої культуральної проти вірусної діареї в об’ємах 2 і 5 см³, що вміщують відповідно 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ і 5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ вакцинного вірусу, забезпечує в імунізованих телят індукцію вірусонейтралізуючих антитіл, які виявляються на 7 добу після введення препарату в титрах 5,0 і 6,0 log₂ відповідно, рівень яких зростає на 28 добу після повторного введення з інтервалом у 14 діб до 6,0 і 7,7 log₂, відповідно, та утримуються на цьому рівні до 60 доби, після чого на 180 добі дещо знижуються до 5,9 і 6,75 log₂.

6. Обґрунтовано та практично підтверджено в експерименті залежність імуногенності виробничого штаму ВК-1М від його інфекційності в щепному об’ємі та кратності введення. Установлено, що з підвищенням дози вірусу в щепному об’ємі від 0,5Ч10^5,45 ТЦД₅₀ до 1Ч10^5,45 ТЦД₅₀ для морських свинок і від 2Ч10^5,45 ТЦД₅₀ до 5Ч10^5,45ТЦД₅₀ для телят за дворазового введення зростає індукція вірусонейтралізуючих антитіл у 1,5 рази в порівнянні з одноразовим і становить 7,3 і 8,0 log₂ відповідно.