Биология с основами экологии Пехов (стр. 134 из 152)
С момента своего возникновения биология и биотехнология всегда развивались совместно, причем с самого начала биология была научной основой биотехнологии. Однако длительное время недостаток собственных данных не позволял биологии оказывать очень большое влияние на биотехнологию. Положение резко изменилось с созданием во второй половине XX в. методологии генетической инженерии, под которой понимают генетическое манипулирование с целью "конструкции новых и реконструкции существующих генотипов. Являясь по своей природе методическим достижением, генетическая инженерия не привела к ломке сложившихся представлений о биологических явлениях, не затронула основных положений биологии подобно тому, как радиоастрономия не поколебала основных положений астрофизики, установление «механического эквивалента тепла» не привело к изменению законов теплопроводности, а доказательство атомистической теории вещества не изменило соотношений термодинамики, гидродинамики и теории упругости.
Генетическая инженерия открыла новую эру в биологии по той причине, что появились новые возможности для проникновения в глубь биологических явлений с целью дальнейшей характеристики форм существования живой материи, с целью более эффективного изучения структуры и функции генов на молекулярном уровне, понимания тонких механизмов работы генетического аппарата. Успехи генетической инженерии означают переворот в современном естествознании. Они определяют критерии ценности современных представлений о структурно-функциональных особенностях молекулярного и клеточного уровней живой материи. Современные данные о живом имеют гигантское познавательное значение, ибо обеспечивают понимание одной из важнейших сторон органического мира и тем самым вносят неоценимый вклад в создание научной картины мира. Таким образом, резко расширив свою познавательную базу, биология через генетическую инженерию оказала также ведущее влияние на подъем биотехнологии.
Генетическая инженерия создает заделы на пути познания способов и путей «конструирования» новых организмов или улучшения существующих организмов, придавая им большую хозяйственную ценность, большую способность резкого увеличения продуктивности биотехнологических процессов.
В рамках генетической инженерии различают генную инженерию и клеточную инженерию. Под генной инженерией понимают манипуляции с целью создания рекомбинантных молекул ДНК. Часто эту методологию называют молекулярным клонированием, клонированием генов, технологией рекомбинантных ДНК или просто генетическими манипуляциями. Важно подчеркнуть, что объектом генной инженерии являются молекулы ДНК, отдельные гены. Напротив, под клеточной инженерией понимают генетические манипуляции с изолированными отдельными клетками или группами клеток растений и животных.
Глава XIX
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Генную инженерию составляет совокупность различных экспериментальных приемов (методик), обеспечивающих конструкцию (реконструкцию) и клонирование молекул ДНК (генов) с заданными целями.
Методы генной инженерии используют в определенной последовательности (рис. 221), причем различают несколько стадий в выполнении типичного генно-инженерного эксперимента, направленного на клонирование какого-либо гена, а именно:
1. Выделение ДНК из клеток интересующего организма (исходного) и выделение ДНК-вектора.
2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного организма на фрагменты, содержащие интересующие гены, с помощью одного из ферментов-рестриктаз и выделение этих генов из образованной рестрикционной смеси. Одновременно разрезают (рестрикциируют) векторную ДНК, превращая ее из кольцевой структуры в линейную.
3. Смыкание интересующего сегмента ДНК (гена) с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК.
4. Введение гибридных молекул ДНК путем трансформации в какой-либо другой организм, например, в Е. coli или в соматические клетки.
5. Высев бактерий, в которые вводили гибридные молекулы ДНК, на питательные среды, позволяющие рост только клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК.
6. Идентификация колоний, состоящих из бактерий, содержащих гибридные молекулы ДНК.
7. Выделение клонированной ДНК (клонированных генов) и ее характеристика, включая секвенирование азотистых оснований в клонированном фрагменте ДНК.
ДНК (исходная и векторная), ферменты, клетки, в которых клонируют ДНК — все это называют «инструментами» генной инженерии.
§ 106 Выделение ДНК
Рассмотрим методику выделения ДНК на примере ДНК плаз-мид. ДНК из плазмидосодержащих бактериальных клеток выделяют с помощью традиционной техники, заключающейся в получении клеточных экстрактов в присутствии детергентов и последующем удалении из экстрактов белков фенольной экстракцией (рис. 222). Полная очистка плазмидной ДНК от белков, РНК и других соединений проводится в несколько стадий. После того как клетки разрушены, например, с помощью лизоцима (растворены их стенки), к экстракту добавляют детергент, чтобы растворить мембраны и инактивировать некоторые белки. Большинство хромосомной ДНК удаляют из получаемых препаратов обычным центрифугированием.
Часто для полной очистки используют хроматографию. Если требуется очень тщательная очистка, используют высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотности CsCI с использованием этидия бромида. Оставшаяся хромосомная ДНК будет фрагментирована в линейную, тогда как плазмидная ДНК останется ковалентно закрытой. Поскольку этидий бромид менее плотен, чем ДНК, то при ультрацентрифугировании в центрифужной пробирке будет «выкручиваться» два кольца — плазмидная ДНК и хромосомная ДНК (рис. 223). Плазмидную ДНК отбирают для дальнейшей работы, хромосомную ДНК выбрасывают.§ 107 Ферменты-рестриктазы и рестрикция ДНК
В ходе эволюции бактерии развили способность синтезировать так называемые рестрицирующие ферменты (эндонуклеазы), которые стали частью клеточной (бактериальной) системы рестрикции-модификации. У бактерий системы рестрикции-модификации являются внутриклеточной иммунной системой защиты от чужеродной ДНК. В отличие от высших организмов, у которых распознание и разрушение вирусов, бактерий и других патогенов происходит внеклеточно, у бактерий защита от чужеродной ДНК (ДНК растений и животных, в организме которых они обитают) происходит внутриклеточно, т. е. тогда, когда чужеродная ДНК проникает в цитоплазму бактерий. С целью защиты бактерии в ходе эволюции развили также способность «метить» собственную ДНК метилирующими основаниями на определенных последовательностях. По этой причине чужеродная ДНК из-за отсутствия в ней метальных групп на тех же последовательностях плавится (разрезается) на фрагменты разными бактериальными рестриктазами, а затем деградируется бактериальными экзонуклеазами до нуклео-тидов. Можно сказать, что таким образом бактерии защищают себя от ДНК растений и животных, в организме которых они обитают временно (как патогены) или постоянно (как сапрофиты).
Рестриктазы впервые были выделены из Е. coli в 1968 г- Оказалось, что они способны разрезать (плавить) молекулы ДНК на разных сайтах (местах) рестрикции. Эти ферменты получили название эндонуклеаз класса I. Затем у бактерий были обнаружены эндонуклеазы класса II, которые распознают в чужеродной ДНК сайты рестрикции специфически и на этих сайтах тоже осуществляют рестрикцию. Именно ферменты этого класса стали использовать в генной инженерии. Тогда же были открыты ферменты класса III, которые плавят ДНК рядом с сайтами распознания, но эти ферменты не имеют значения в генной инженерии.
Действие системы рестрикции-модификации «рационализуется» так называемыми палиндромными (распознающими последовательностями) азотистых оснований, которые являются сайтами рестрикции ДНК. Палиндромные последовательности — это последовательности оснований, которые одинаково читаются вперед и назад, как, например, последовательность букв радар. Поскольку цепи ДНК обладают антипараллельным направлением, то считают, что последовательность является палиндромной, если она идентична, когда читается в направлении от 5'- к 3'-концу на верхней и 3'- к о'-концу на нижней цепи, а именно:
Палиндромы могут быть любых размеров, но большинство тех палиндромов, которые используют в качестве сайтов узнавания рестриктазами, состоят из 4, 5, 6 и реже 8 оснований.
Рестриктазы — это абсолютно необходимый инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктаз и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК.
Замечательной особенностью рестриктаа является то, что они продуцируют разрезы молекул на несколько фрагментов (рестрик-тов) ДНК уступами, в результате чего в образующихся концах одна цепь длиннее другой, образуя своеобразный хвост. Такие концы (хвосты) получили название «липких» концов (рис. 224), т. к. они способны к самокомплементарности.