ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).
Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -
mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,
спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,
1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается
резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол-
ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини-
ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована
нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей
транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже-
на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо-
на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).
В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи-
альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина
человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали
после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер-
ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро-
фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив-
ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,
1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-
венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант-
ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной
ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных
(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче-
видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да-
лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты
исследователей о перспективности генной терапии МД по срав-
нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных
миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини-
ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу
IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи-
мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро-
фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен-
но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования
по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и
в нашей стране.
10.4.3 Гемофилия А.
Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное
наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в
системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора
YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х
компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном
F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя-
зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге-
ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули-
рует его активность.
Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер-
жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая
длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо-
дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009
нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность
(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806
п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в
интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не-
известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами
молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт-
роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в
направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый
экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие
его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется
он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена
экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;
Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22
оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-
ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи-
тельное место локализации бинаправленного промотора для ге-
нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб
в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые
копии гена F8A (Lakich et al.,1993).
Во время процессинга первичного белкового продукта гена
F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от-
щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В
плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого
гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и
N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с
гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко-
личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-
тивность белка сохранена, но его количество резко снижено
(McGinnis et al.,1993).
Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -
семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают
в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal
et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,
что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя-
ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме
того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,
могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что
вероятность повторного рождения больного ребенка у них также
повышена.
Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 яв-
ляются делециями одного или нескольких смежных экзонов. При-
мерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дуплика-
ции гена, остальные мутации - точковые замены (Antonarakis
et al.,1995). Почти половина миссенс мутаций идентифицирова-
на в домене A2. Показано, что 35% всех известных мутаций ло-
кализовано в CpG динуклеотидах, причем свыше 90% из них
представляют собой C-T или G-A транзиции (Cooper,
Youssoufian, 1988). Подобные мутации в кодирующих районах
встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на
основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего
большинства мутаций гена F8C характерно практически полное
отсутствие "горячих" точек: каждая семья высокого риска по
гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение
составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протя-
женных инверсий интрона 22, захватывающих экзоны 1-22 и пол-
ностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказа-
лось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии А
(Lakich et a.,1993). Причиной инверсий в этой области гена
является гомологичная рекомбинация между идентичными после-
довательностями гена F8А, расположенного в интроне 22
F8C-гена, и другими копиями этого же гена,находящимися на
расстоянии 500 кб от 5'конца гена F8 (см.выше).
Помимо инверсий и точечных мутаций в гене ФVIII заре-
гистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза,
связанных с перемещением в геноме транспазонподобных элемен-
тов типа LINE ( см. Главу II). У двух пациентов неродствен-
ного происхождения был идентифицирован инсертированный в эк-
зоне 14 F8C-гена длинный элемент LINE-1 (L1) (Kazazian et
al.,1988). В обеих семьях это были мутации de novo. L1
последовательности представляют собой специфическое для ге-
нома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 кб, пов-
торяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и
состоящее, примерно, из 100 000 копий. Было показано что оба
L1 элемента, инсертированные в F8C-ген, родственны ретрот-
ранспозону, локализованному на хромосоме 22 (Dombroski et
al., 1991). В третьей семье инсертированный в интроне 10
F8C-гена L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 эле-
мента имели открытые рамки считывания, а соответствующие ре-
конструируемые аминокислотные последовательности были высоко
идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%.
Таким образом, были получены еще одни косвенные подтвержде-
ния существования ряда функциональных L1 элементов, кодирую-
щих 1 или несколько белков, необходимых для их ретротранспо-
зиции.
Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осу-
ществляется путем блот-гибридизации с ДНК зондом р482.6 c
последующей рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1
(Lakich et al.,1993). В остальных случаях, в силу отсутствия
мажорных мутаций в гене F8C, чаще всего используют косвенные
методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют
полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII по-
лиморфизм в интроне 19; HbaI полиморфизм в интроне 22 и вне-
генный полиморфизм локуса DXS52 (St14/TaqI) (Асеев и др.,
1989; Aseev et al., 1994; Сурин и др., 1990).
Учитывая наличие функционально активной формы белка
фактора VIII в плазме крови генноинженерые подходы в терапии
этого заболевания направлены на получение в чистом виде пол-
ноценного белкового продукта (заместительная терапия), либо
на введение в организм больного соответствующей кДНК,
обеспечивающей синтез ФVIII и его поступление в кровь. Осу-
ществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого
гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о
получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен
ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты
полноценного белкового продукта. Генная терапия этого забо-
левания находится на стадии экспериментальных разработок
(см.Главу IX). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов
человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная
проблема в данном направлении заключается в выборе эффектив-
ного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена
могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены
невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длитель-
ную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возмож-
ных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты,
гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994г. методом нап-
равленного мутагенеза (см.Главу VIII) получены трансгенные
модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что