морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана-
лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно
повысили возможности локализации неизвестных признаков на
геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000
клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли-
морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-
ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи-
ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени
это анонимные последовательности, связь которых со специфи-
ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего
соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло-
на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая
номенклатура для обозначения используемых в качестве марке-
ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,
что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-
ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-
мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.
Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-
нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-
кая информативность (частота гетерозигот не может превышает
50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение
ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-
шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-
тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК
последовательностей в качестве индексных генетических марке-
ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-
ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-
лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно
распределенных по хромосомам практически завершенаа
(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система
построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.
(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс
простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-
чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-
мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных
на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются
после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более
90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-
ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В
1992г. группе французских ученых под руководством Жана
Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-
мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации
(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из
814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-
нием между ними около 5 сМ, получившую название
Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et
al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000
фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем
ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры
для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-
жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.
Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000
(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих
участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-
дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-
лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-
тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-
держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта
сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-
нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.
Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а
суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%
всего генома человека.
К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до
2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен
до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти-
вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста-
ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру-
ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического
скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих
весь геном человека со средним расстоянием между соседними
маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из
Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни-
ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по-
лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),
причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены
четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково-
го молекулярного веса можно было различить на электрофорег-
рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9
STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо-
ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.
Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим
сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.
Только с помощью одного автоматического сканнера удается
проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в
день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва-
ет самые широкие возможности не только для генетического
картирования и создания подробных карт сцепления практически
любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,
она делает реальной разработку стратегии картирования генов,
мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-
леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,
психозы и многое другое.
Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,
пульсирующий гель-электрофорез.
Используя столь обширную систему молекулярных маркеров
и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур
или на материале информативных родословных можно довольно
быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не
только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-
ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-
посредственно к позиционному клонированию с целью выделения
и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в
картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим
подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-
ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-
мосом и их фрагментов.
Точность цитогенетического картирования определяется
степенью спирализации хромосом, характером использованной
метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-
вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах
и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-
рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-
том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При
использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах
точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1
миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и
растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50
тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,
даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар-
тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-
чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.
Значительно более точные результаты достигаются на 2-м
этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.
Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на
рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.
Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети-
ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление
этих типов физических карт практически невозможно.
Одним из способов преодоления этих трудностей является
конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как
уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких
библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги-
бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме-
ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото-
рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб-
лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.
Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен-
ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь
часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны
могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото-
рых механически, под контролем микроманипулятора может быть
вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.
Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и
идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз-
мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным
после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК
на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти-
дов (Estivill, Williamson, 1987).
Другим важным шагом на пути клонирования и анализа
больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка
методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую-
щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith
et al., 1987). В соответствии со стандартными методами
электрофореза под действием однонаправленного постоянного
поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде-
лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.
Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем
изменении направления электрического поля происходит, по
-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных