в ядро и, если не разрушается эндогенными нуклеазами, то мо-
жет быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случает-
ся достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы,
в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и
низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1
года) может сохраняться и даже экспрессироваться в миофиб-
риллах (Hansen et al.,1991).
Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в
ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции
(метод применяемый сегодня почти исключительно для создания
трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронук-
леус оплодотворенной яйцеклетки - cм.Главу VIII); при помощи
электропорации (кратковременного воздействия сильным элект-
рическим полем); путем перфорации клеточных мембран золотыми
или вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными с чужерод-
ными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбарди-
ровки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для
клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь
метод бомбардировки, который при наличии специального генно-
го "ружья" с успехом применяется и in vivo (Yang et
al., 1990).
Для повышения эффективности переноса обычно используют
системы доставки - соединения или группы соединений, взаимо-
действующие с ДНК с образованием компактных структур, облег-
чающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от дейс-
твия нуклеаз (Власова и др., 1994). Самой простой системой
доставки является система кальций-фосфатной копреципитации,
широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более
сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет
собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий
создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной конс-
трукции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус (Рис. 9.2). В ка-
честве лигандов используются специфические белки, такие как
трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, коньюгирован-
ный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействую-
щие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию ген-
ной конструкции на специфических клетках, то есть адресную
доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (напри-
мер асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и
эритропоэтин - в клетки крови и.т.д). Лиганды ковалентно
присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК
катионным носителям (полилизину, DEAE-Dextran и др.).
Важным компонентом системы является аденовирус или его
N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фу-
зогенных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эн-
досом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адрес-
ная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов
обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конс-
трукций, их несомненную перспективность для генной терапии
in vivo (Hodgson, 1995).
Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и
физико-химического подхода при конструировании систем для
переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем осно-
вана на использовании филаментного фага fd для трансфекции
эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фа-
га, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсер-
тируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полили-
зиновые остатки в составе слитого белка связываются с плаз-
мидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген
оболочки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую
какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной
поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обес-
печивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью
были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражаю-
щих кишечный эпителий - интерналин и инвазин, а также после-
довательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабель-
ного района моноклональных антител Ab11. Было показано, что
во всех трех случаях достигается адресная доставка и интер-
нализация фага в клетки-мишени, то есть система успешно
функционирует.
Направленный перенос генов во многие типы клеток, со-
держащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен
при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в
этом комплексе аденовирусного вектора существено облегчает
прохождение ДНК через эндосомы и попадание её в ядро. Иде-
альными белковыми лигандами для специфических клеточных ре-
цепторов могут служить моноклональные антитела или их фраг-
менты, направленные против тех элементов рецепторов, которые
находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подоб-
ная система разработана для рецептор-опосредованного генного
переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использова-
нии противо-секреторных SCFab-фрагментов антител для поли-
мерного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Этот рецептор
транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клет-
ки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндо-
цитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции
эпителиальных клеток при использовании SCFab-поли-L-ли-
зин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной
ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные под-
ходы могут быть применены для введения генов и в другие типы
клеток.
9.4.3 Липосомный метод трансфекции.
Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от дег-
радации лизосомальными ферментами достигаются при использо-
вании в качестве векторов липосом-липидных пузырьков, обла-
дающих выраженными фузогенными свойствами - способностью
сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в
этом отношении липосомы, полученные на основе катионных ли-
пидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные
нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности
таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрица-
тельно заряженными клеточной мембранами и прямое попадание
чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответствен-
но, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эф-
фективный перенос высокоочищенных ДНК или РНК-последователь-
ностей в соматические, особенно, в мышечные ткани может быть
осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофекта-
мина (Caplen et al., 1994). Гораздо более высокая частота
трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом
получена в экспериментах на культурах клеток при использова-
нии ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим
пептидом грамицидином S.
Особенно перспективными в последнее время представляют-
ся комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными
антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы)
либо с белками-лигандами (см.выше). Эти конструкции обеспе-
чивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клет-
ки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для пе-
реноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты
линейных крыс Nagase с наследственной дисальбуминемией. До-
казано присутствие и экспрессия введенного таким образом ге-
на человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты
получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных
по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти жи-
вотные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболе-
ваний человека - семейную гиперхолесеринемию. При внутривен-
ной иньекции кроликам липидного асиалогликопротеинового
комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уро-
вень холестерина в крови животных устойчиво понижался.
Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем на
основе липосом является их низкая иммунореактивность. Они
лишены и многих других недостатков, свойственных вирусным
векторным системам. Вместе с тем, до сих пор не решена проб-
лема низкой частоты трансформации клеток при липосомном пе-
реносе. Это обстоятельство существенно ограничивает примене-
ние липосом в генной терапии (Crystal, 1995). Тем ни менее,
в настоящее время рецептор-опосредованный вариант передачи
генетической информации в клетки эукариот с использованием в
качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков,
а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в
одной системе совместить преимущества физико-химических ме-
тодов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет
один из наиболее перспективных и быстро развивающихся нап-
равлений в трансфекции эукариотических клеток.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
Конструирование векторов на базе вирусов представляет
собой наиболее интересный и перспективный раздел генотера-
пии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективно-
го проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и
система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматри-
вать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для кле-
ток млекопитающих. Действительно, только с помощью вирусных
векторов пока удается достичь такого уровня трансфекции кле-
ток человека in vitro и in vivo, который необходим для про-
явления лечебного эффекта. Это доказывают многочисленные
эксперименты на животных и первые клинические испытания ут-
вержденных программ генотерапии (см. 9.2). Вместе с тем,
нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологи-
ческих процессов, связанных с использованием вирусных час-
тиц. В качестве векторов применяют следующие рекомбинантные