(см.ниже). Следует также подчеркнуть, что качественный ска-
чок в области генной терапии, когда сам ген стал рассматри-
ваться как лекарственный препарат, стал возможен благодаря
тому, что предшествующие экспериментальные и клинические
исследования доказали безопасность генной терапии.
Вместе с тем, и в сегодняшних исследованиях по генной
терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирова-
ния генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недоста-
точно. Следует помнить, что введение в организм человека
последовательностей ДНК, не находящихся под контролем свойс-
твенных им регуляторных элементов, может приводить к трудно
предсказуемым измененим метаболических процессов и сопровож-
даться функциональным дисбалансом. Современные представления
о структуре генома и его взаимодействиях с экзогенными ДНК и
вирусными последовательностями, часто используемыми в ка-
честве векторов для переноса генов (см. 9.2), могут оказать-
ся недостаточными для прогнозирования возможных нежелатель-
ных или неконтролируемых последствий такого вмешательства.
Поэтому при разработке программ генной терапии принципиаль-
ное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем
лечения как для самого пациента, так и для популяции в целом
(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важно, чтобы при проведении
испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получе-
ния дополнительной полезной информации превосходили потенци-
альный риск предлагаемой процедуры. Неслучайно, в странах с
наиболее продвинутым уровнем исследований в этой области,
особенно в США, медицинские протоколы с использованием смыс-
ловых последовательностей ДНК подвергаются обязательной экс-
пертизе в соответствующих комитетах и комиссиях. Клинические
испытания предложенной генотерапевтической процедуры возмож-
ны только после ее одобрения соответствующим законодательно
утвержденным органом. В США таковыми являются: Консультатив-
ный Комитет по Рекомбинантным ДНК (Recombinant DNA Advisory
Committee - RAC), Комитет по лекарствам и пищевым продуктам
(Food and Drug Administration -FDA), с последующим обяза-
тельным утверждением проекта директором Национального Инсти-
тута Здоровья (National Institute of Health) (Miller, 1992;
Anderson, 1992; Culver, 1994). В Европе такие протоколы сос-
тавляются и утверждаются в соответствии с рекомендациями Ев-
ропейской Рабочей Группы по Переносу Генов и Генной Терапии
(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy)
(Cohen-Haguenauer, 1995). Программы генной терапии для кли-
нических испытаний должны включать следующие разделы: обос-
нование выбора нозологии для проведения курса генной тера-
пии; определение типа клеток, подлежащих генетической моди-
фикации; схему конструирования экзогенной ДНК; обоснование
биологической безопасности вводимой генной конструкции,
включающая опыты на культурах клеток и на модельных (транс-
генных) животных; разработку процедуры ее переноса в клетки
пациента; методы анализа экспрессии введенных генов; оценку
клинического (терапевтического) эффекта; возможные побочные
последствия и способы их предупреждения (Culver, 1993; Co-
hen-Haguenauer, 1995).
Важнейшим элементом в программе генной терапии является
анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль прово-
дят на всех этапах терапии, причем исследования выполняют на
различных уровнях. Прежде всего, после переноса гена осу-
ществляют поиск модифицированных клеток в организме пациента
и следят за динамикой этих клеток в определенных тканях.
Этот поиск может быть облегчен при наличии маркерного гена в
конструкции. Присутствие последовательностей экзогенной ДНК
в модифицированных клетках чаще всего идентифицируют с по-
мощью ПЦР. На следующем этапе производят анализ экспрессии
введенных генов путем идентификации и количественной оценки
соответствующего РНК-транскрипта, либо белкового продукта
гена. В тех случаях, когда это возможно, проводят анализ
коррекции первичного биохимического дефекта. Затем, все по-
лученные данные сопоставляют с результатами комплексного ме-
дицинского обследования и вносят необходимые исправления и
добавления в проводимую схему лечения.
Раздел 9.2. Типы генотерапевтических вмешательств, вы-
бор клеток-мишеней.
Рассмотрим наиболее общие принципы, лежащие в основе
построения программ генной терапии. Итак, генная терапия
предполагает введение последовательностей ДНК в клетки-мише-
ни. Она проводится либо с целью коррекции наследственной па-
тологии, возникшей вследствие генетического дефекта, либо
для придания этим клеткам новых функций, способствующих уст-
ранению патологических процессов. В первом случае, в орга-
низм больного вводят нормально работающий гомолог дефектного
гена. Второй подход применяют при лечении, таких заболева-
ний, как опухоли или инфекции. В этих случаях вводят гены,
обладающие условным цитотоксическим эффектом или способству-
ющие формированию выраженного иммунного ответа. Мишенями для
таких генов служат пораженные ткани, иммунные клетки, специ-
фическим образом проникающие в эти ткани, либо предваритель-
но трансформированные in vitro другие клетки. Таким образом,
в зависимости от характера заболевания и предполагаемого ге-
нотерапевтического подхода объектом генетической трансфекции
могут служить самые разные соматические клетки, как несущие
дефектный ген, так и нормальные клетки, приобретающие тера-
певтические свойства после трансфекции. В зависимости от
способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная те-
рапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo),
либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная
терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культи-
вирование специфических типов клеток пациента, введение в
них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реин-
фузию их тому же пациенту (Рис. 9.1). В настоящее время
большинство допущенных к клиническим испытаниям программ
генной терапии использует именно этот подход (Cul-
ver, 1994). Осуществление таких программ возможно лишь в
крупных специализированных центрах, требует больших матери-
альных затрат и высоких биотехнологий.
Генная терапия in vivo основана на прямом введении кло-
нированных и определенным образом упакованных последователь-
ностей ДНК в специфические ткани больного. При этом вводимые
ДНК, как правило, интегрируют с молекулами, обеспечивающими
их адресную доставку в клетки-мишени (см. 9.3). Этот очень
перспективный подход, расчитанный на массовое лечение широко
распространенных заболеваний, пока реально апробирован толь-
ко для лечения муковисцидоза (Crystal et al., 1994). Особен-
но перспективным для лечения генных болезней in vivo предс-
таляется введение генов с помощью аэрозольных или иньецируе-
мых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как
правило, для лечения пульмонологических заболеваний, таких
как муковисцидоз, энфизема, рак легких, при которых обьекта-
ми генетической модификации являются специфические типы ле-
гочных клеток (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцины могут
использоваться для модификации различных типов клеток и со
временем, по-видимому, станут наиболее распространенным и
универсальным способом доставки чужеродного генетического
материала в любые ткани.
Эффективность курса генной терапии в значительной сте-
пени зависит от правильного выбора типов соматических кле-
ток, в которых должна бать проведена генетическая модифика-
ция. Так например, при лечении какого-либо наследственного
заболевания, обусловленного дефектом секреторного белка, ге-
нетической коррекции, в принципе, могут быть подвергнуты лю-
бые клетки, тогда как для нерастворимых или мембран-связан-
ных белков выбор ограничен теми клетками, где экспрессирует-
ся соответствующий ген (см.раздел 8.5). Разработке программы
генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифи-
ческой экспрессии соответствующего гена, идентификация пер-
вичного биохимического дефекта, исследование структуры,
функции и внутриклеточного распределения его белкового про-
дукта, а также биохимический анализ патологического процес-
са. Все эти данные учитываются при составлении соответствую-
щего медицинского протокола. Кроме того, план генотерапевти-
ческих вмешательств определяется также доступностью кле-
ток-мишеней, периодом их жизни и характером миграции в орга-
низме, эффективностью и специфичностью трансфекции кле-
ток, длительностью экспрессии введенного гена.
Наиболее перспективной представляется возможность гене-
тической модификации не самих уже дифференцированных клеток
с наследственным дефектом, а их предшественников, то есть
долго живущих стволовых клеток. В частности, многообещающей
является трансформация тотипотентных эмбриональных стволовых
клеток, которые при создании определенных микроусловий могут
дифференцироваться, практически, в любые соматические клетки
организма (Hodgson, 1995). Следует упомянуть в этой связи
предложенный недавно эффективный метод получения стволовых
клеток гемопоэтического ряда, перспективных для генотерапии
наследственных заболеваний крови (Berardi et al., 1995).
Как правило, определение типа клеток, подлежащих гене-
тической модификации, завершается оценкой результатов пере-
носа гена в системе in vitro и проведения экспериментов на
животных моделях в тех случаях, когда это возможно. Апроба-
цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания про-