достаточно полной информации о структуре гена и о его пер-
вичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом
тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области
гена, отсюда для получения более полной информации необходи-
ма амплификация многих экзонов.
Стратегия идентификации мутаций может быть различной и,
в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее
неизвестными мутациями, либо целью анализа является скрини-
рование уже известных мутаций. В первом случае обектом
исследования чаще всего служат клонированные или амплифици-
рованные кДНК-овые последовательности, тогда как при молеку-
лярной диагностике известных мутаций, как правило, анализи-
руют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.
Раздел 4.5. Первичная идентификация точечных мутаций.
Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого
секвенирования мутантной кДНК или отдельных экзонов и часто
первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осу-
ществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже
был рассматрен ранее ( см.Главу I,раздел 1.6). Для некоторых
генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирова-
ния с успехом применяется как основной метод сканирования
мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его
применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по
размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертыва-
ния крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для
получения амплифицированных кДНК-овых фрагментов открывает
особенно широкие возможности для применения метода прямого
секвенирования.
Разработаные в последние годы модификации методов ПЦР
значительно облегчили секвенирование амплифицированных фраг-
ментов и повысили его эффективность. Так, в частности, пред-
ложен вариант ассиметричной ПЦР, когда при амплификации кон-
центрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз
превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего
синтезируется преимущественно только одна, нужная для секве-
нирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепо-
чечной ДНК) предложено использование магнитных частиц с
фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом
один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем
к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с при-
шитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин -
стрептовидин, меченая биотином последовательность ДНК фикси-
руется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с
частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последова-
тельность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще
в одном варианте амплификацию проводят в присутствии прайме-
ров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК полимера-
зы. После амплификации в системе in vitro проводят
транскрипцию амплификата с помощью Т7-РНК полимеразы и обра-
зовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования
- метод GAWTS (genome amplification with transcript
sequences).
Однако, в общем случае секвенирование полноразмерной
кДНК или всех экзонов для генотипирования мутаций у отдель-
ных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует много
времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный
отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда
клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих
мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы
поиска фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации,
основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных
последовательностей по целому ряду физических и химических
характеристик, которые в значительной степени варьируют в
зависимости от типа мутационного повреждения. Следует под-
черкнуть, что независимо от метода детекции мутации и прак-
тически независимо от её природы (замены нуклеотидов, деле-
ции, дупликации и пр.) точные молекулярные характеристики
каждой мутации могут быть получены только путем прямого сек-
венирования. При наличии в амплифицированном фрагменте из-
вестных сайтов рестрикции положение мутации может быть пред-
варительно уточнено. Для этого продукты амплификации разре-
зают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более корот-
кие фрагменты.
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие дли-
ну амплифицированных фрагментов, так как подобные нарушения
легко выявляются при электрофоретическом анализе. Так, про-
тяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть вы-
явлены по изменению длины рестрикционных фрагментов, гибри-
дизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и
эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцеп-
ленных с полом, основана на одновременной амплификации раз-
личных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные пе-
рестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разни-
ца в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет
легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе
(Рис.4.2). Особенно широко этот метод используется для иден-
тификации делеций в гене дистрофина, на долю которых прихо-
дится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дю-
шенна (см.Главу X). При отсутствии делеций все амплифициро-
ванные фрагменты после электрофоретического разделения и ок-
рашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в
исследуемой ДНК какие-то из экзонов делетированы, будут
отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофорег-
рамме (Рис.4. 2). Выбирая специфические участки гена для ам-
плификации, можно оценить размер делеции с точностью до от-
дельных экзонов, а также определить ее внутригенную локали-
зацию.
Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции,
находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в
аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последова-
тельность геномной ДНК может служить матрицей для амплифика-
ции любых фрагментов. Данный подход применим к анализу деле-
ций в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно
дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплифика-
ции - так называемая количественная ПЦР. Оригинальный метод
идентификации подобных делеций у гетерозигот основан на
использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полу-
ченной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или
из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей
или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомо-
лога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны
сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выб-
раны последовательности из этих областей гена, только му-
тантная кДНК будет служить матрицей для амплификации неболь-
шого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзо-
нов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может
быть слишком велик, для того чтобы прошла амплификация.
Практически, для обнаружения гетерозигот по протяженным
внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с исполь-
зованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию
фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Нали-
чие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации
необычного размера.
Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к
отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их
размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при
электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или
агарозном гелях (Рис.4.3). Именно этот метод используется
для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене му-
ковисцидоза - делеции трех нуклеотидов ^F508. После выявле-
ния различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рест-
рикционных или амплифицированых фрагментов гена необходимо
провести секвенирование необычного фрагмента, с целью опре-
деления изменений в первичной структуре мутантной ДНК после-
довательности по сравнению с нормальной.
При мутациях гена, представляющих собой замену одного
или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагмен-
тов остаются постоянными, однако, некоторые физико-хими-
ческие свойства мутантных молекул ДНК меняются. Так, напри-
мер, при гибридизации однонитевых ДНК, комплементарных нор-
мальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные наруше-
ния в месте негомологичного спаривания. С учетом этих осо-
бенностей разработаны различные варианты поиска мутантных
фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Веду-
щими из этих методов являются: метод анализа конформационно-
го полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий гра-
диентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщеп-
ления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексно-
го анализа (HA) и, наконец, собственно метод секвенирования
Основные характеристики этих методов приведены в Табл.4.3
Таблица 4.3. Преимущества и недостатки основных методов пер-
вичной идентификации мутаций.
-------T---------T--------T------------T----------------¬
¦метод ¦ размер ¦ %% ¦ точность ¦ сканирование ¦
¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+---------T------+
¦ ¦ (п.о.) ¦мутаций ¦ мутации ¦ экзонов ¦ кДНК ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------+---------+--------+------------+---------+------+
¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ нет ¦ +++ ¦ + ¦
¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ нет ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦СМС ¦ 1700 ¦>95% ¦ да ¦ + ¦ +++ ¦
¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ да ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ нет ¦ ++ ¦ + ¦
L------+---------+--------+------------+---------+-------
"+" - применимость метода для сканирования геномной ДНК и