водят на первичных культурах экспрессирующих клеток больного
либо на перевиваемых культурах, полученных после предвари-
тельной трансформации первичных культур. На этих клеточных
моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса
экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической
конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клет-
ки, отрабатывают способы идентификации первичного дефекта и
его коррекции на биохимическом уровне.
Однако, многие проблемы генной терапии не могут быть
решены на уровне клеток. Важное значение имеет анализ влия-
ния введенных ДНК-последовательностей на межклеточные взаи-
модействия, определяющие работу соответствующих тканей и ор-
ганов. Такие исследования могут быть проведены только in vi-
vo. Так, например, в культуре клеток можно определить коли-
чество синтезированного белка, необходимое для нормализации
биохимического дефекта, но этих данных недостаточно для от-
вета на вопрос, какое количество клеток в организме должно
быть модифицировано для восстановления нарушенной функции.
Используя культуры клеток, можно разработать биохимическую
систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако, про-
верка надежности работы этой системы может быть осуществлена
только на уровне целого организма. Показатели длительности и
характера экспрессии введенного гена в культуре клеток могут
использоваться лишь в качестве ориентировочных параметров
для оценки необходимой периодичности повторения терапевти-
ческих процедур. Кроме того, многие побочные эффекты и, в
первую очередь, возможные ошибки в регуляции эспрессии чуже-
родного гена и опасность вирусной контаминации в результате
использования компетентного по репликации вектора (см.ниже),
могут быть выявлены только in vivo. Поэтому такое внимание в
программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo
на естественных или искусственно полученных моделях соот-
ветствующих наследственных болезней у животных (см.Главу
VIII). Успешная коррекция генетических дефектов у таких жи-
вотных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной
терапии является важнейшей предпосылкой для разрешения кли-
нических испытаний.
Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-
рапии.
Решающим условием успешной генотерапии является обеспе-
чение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком
смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векто-
ров) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель-
ной персистенции его в этих клетках и создание условий для
полноценной работы, то есть экспрессии. Трансфекция может
проводиться с использованием (1) чистой ("голой"-naked) ДНК,
лигированной в соответствующую плазмиду, либо (2) комплекси-
рованной ДНК - плазмидная ДНК комплексированная с солями,
белками (трансферрином), органическими полимерами (DEAE -
декстраном, полилизином, липосомами или частицами золота),
либо (3) ДНК в составе вирусных частиц, предварительно ли-
шенных спсобности к репликации. Залогом длительной персис-
тенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее
встраивание в геном, то есть в ДНК клетки-хозяина. Пребыва-
ние экзогенной ДНК в ядре в свободном состоянии (в виде, так
называемых, эписом) с неизбежностью ведет к ее элиминации
даже в неделящихся клетках и, соответственно, к транзиторной
экпрессии (обычно, в течение нескольких месяцев). Необходи-
мой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие
соответствующих промоторов, причем в случае наличия тканес-
пецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного
гена только в определенных тканях и клетках (см.ниже). Ос-
новные методы доставки чужеродных генов в клетки подразделя-
ются на химические, физические и биологические. Эффектив-
ность трансфекции и интеграционная способность трансдуциро-
ванной чужеродной ДНК при различных способах трансфекции в
ДНК-клетки мишени приведены в Табл.9.1.
Таблица 9.1. Основные характеристики генетической трансфек-
ции in vitro (Culver, 1994).
--------------------T------------T-------------T------------¬
¦ Методы ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Экспрессия ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Химические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦
¦ преципитация ¦ низкая ¦ низкая ¦трнзиторная ¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦ Физические: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ Электропорация ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ Микроинъекция ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ "Бомбардировка" ¦ ¦ ¦ ¦
¦ частицами золота ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦Слияние: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Липосомы ¦ низкая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦
¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦
¦комплекс ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусная капсида ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
+-------------------+------------+-------------+------------+
¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦
¦вирусы: ¦ ¦ ¦ ¦
¦Аденовирус ¦ высокая ¦ низкая ¦транзиторная¦
¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ванный вирус (AAV) ¦ высокая ¦ низкая ¦длительная ?¦
¦Вирус герпеса (HSV)¦ низкая ¦ низкая ¦слабая ¦
¦Вирус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦
¦дефицита (HIV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус мышиной лейке¦ ¦ ¦ ¦
¦мии Молони (MoMLV) ¦ высокая ¦ высокая ¦длительная ?¦
¦Вирус ветряной ¦ ¦ ¦ ¦
¦оспы (Vaccinia) ¦ высокая ¦ низкая ¦слабая ¦
L-------------------+------------+-------------+-------------
Как следует из представленных данных, введение чужерод-
ных генов in vitro может быть весьма эффективно как при по-
мощи некоторых физических способов доставки (электропоации,
бомбардировки частицами золота), так и, практически, при
всех вариантах биологической доставки, особенно, с помощью
рекомбинантных вирусов. Однако, реально интеграция в геном
клетки-реципиента может быть достигнута только в случае рет-
ровирусных или адено-ассоциированных векторов, обладающих
необходимыми для встраивания в эукариотическую ДНК свойства-
ми. При этом отсутствие встраивания в геномную ДНК, как пра-
вило, коррелирует с транзиторной (временной) экспрессией ге-
на. Следовательно, только вирусные векторы или генетические
конструкции, включающие вирусные последовательности способны
к активной трансфекции, а в ряде случаев и к длительной экс-
прессии чужеродных генов. Следует напомнить в этой связи,
что из 100 уже одобренных проектов генотерапии 95 предпола-
гают использовать вирусную трансдукцию и 86 из них основаны
на применении ретровирусных векторов.
Несмотря на усилия многих генно-инженерных лабораторий,
Центров, а в последнее время и фармацевтических фирм, от-
сутствие идеальных векторов, обладающих эффективной (100%)
трансфекцией как ex vivo так и in vivo, в сочетании с высо-
кой пакующей способностью (включение генетической конструк-
ции от 1 до 1 000 тысяч п.о.), интегрирующих в геном или не-
интегрирующих, но обеспечивающих длительную и, что особенно
важно, регулируемую экспрессию, при отсутствии опасности он-
когенных модификаций или иных нежелательных побочных эффек-
тов, продолжает оставаться одним из серьезных препятствий на
пути внедерения генотерапии (Hodgson, 1995).
Раздел 9.4. Конструирование векторных систем и совер-
шенствование методов трансформации клеток
человека.
9.4.1. Основные векторные системы.
В Табл.9.1 приведены основные типы векторных систем.
Остановимся подробнее на способах их конструирования, преи-
муществах и недостатках, некоторые из которых уже упомина-
лись в предыдущем разделе. Как правило, вводимая генетичес-
кая конструкция представляет собой полноразмерную кДНК-овую
последовательность определенного гена, инсертированную в
экспрессионный вектор, то есть находящуюся под действием
сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от
многих параметров, главным из которых является необходимый
уровень экспрессии гена в клетках-мишенях. Вектор часто со-
держит один из маркерных генов, таких как гены neo, бе-
та-Gal, ген люциферазы и др., присутствие которых в трансду-
цированных клетках может быть легко обнаружено по наличию
либо соответствующего белкового продукта (гистохимически для
генов бета-Gal и люциферазы), либо маркерных последователь-
ностей ДНК. Если в качестве маркера выбран селектируемый ген
(neo), отбор клеток, трансфецированных in vitro, может про-
изводиться автоматически на соответвтвующих селективных сре-
дах. Существует два типа конструкций; один - на основе плаз-
мидной ДНК, другой - на базе вирусов. Плазмидные конструкции
удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций и по-
лучения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бак-
териальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не
способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки.
Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в
клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирус-
ный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение
через клеточные мембраны.
9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в
клетки эукариот.
Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно
проникать в клетки эукариот, благодаря наличию на наружных
клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК.
Путем эндоцитоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чу-
жеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где
обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только
небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает