Смекни!
smekni.com

Литература - Другое (книга по генетике) (стр. 18 из 64)

форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогесте-

рон ведет к дефициту альдостерона, что в свою очередь нару-

шает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к

быстрой потере соли плазмой крови (соль теряющая форма).

Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим

геном гомологичной ДНК последовательности зачастую ведет к

нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к

конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на

псевдоген), либо к делеции части смыслового гена. В обоих

случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций

приходится около 40% мутаций, на долю конверсий - 20% и при-

мерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечествен-

ным данным в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС,

на долю конверсий приходится более 20% мутантных хромосом,

на долю делеций - около 10% (Evgrafov et al., 1995).

Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования

тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA A и HLA B генов,

а также алелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК диагностика АГС

основана на амплификакции с помощью ПЦР отдельных фрагментов

генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами HaeIII

или RsaI и анализе полученных фрагментов после электрофореза

(Evgrafov et al., 1995).

10.4.10 Спинальная мышечная атрофия.

Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессив-

ное заболевание, характеризуется поражением моторных нейро-

нов передних рогов спинного мозга, в результате чего разви-

ваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища.

Это - второе после муковисцидоза наиболее частое летальное

моногенное заболевание (частота 1: 6 000 новорожденных).

СМА подразделяется на три клинические формы. Тип I. Острая

форма (болезнь Верднига-Гоффмана), проявляется в первые 6 ме-

сяцев жизни и приводит к смерти уже в первые два года; Тип

II. Средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять,

но обычно живут более 4-х лет; Тип III. Ювенильная форма

(болезнь Кугельберга-Веландера) - прогрессирующая мышечная

слабость после 2-х лет. Все три формы представляют собой ал-

лельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor

neurons), картированного в локусе D5S125 (5q13) и идентифи-

цированного методом позиционного клонирования (см.Главу III)

в 1995г (Lefebvre et al. 1995). В этой пока единственой ра-

боте показано, что ген SMN размером всего 20 000 п.о.состоит

из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1 700 п.о. и кодирует

ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с

молекулярным весом 32 КилоДальтона.

Ген дуплицирован. Его копия (возможно вариант псевдоге-

на) располагается несколько ближе к центромере и отличается

от гена SMN наличием 5-и точечных мутаций, позволяющих отли-

чить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследо-

ванием методом SSCP анализа (см.Главу IV). Ген назван

сBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для

теломерной копии, т 4о 0е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541

экспрессируется, но в отличие от гена SMN его сДНК подверга-

ется альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7.

Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229),

его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных

пациентов (5.6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся

3-х больных дали основание именно данную теломерную копию

гена считать ответственной за заболевание. Существенно отме-

тить, что центромерная копия гена обнаружена у 95 4. 05% боль-

ных, 4тогд 0а 4как 0 отсутств 4ует она 0 только у 4,4% 4 пациентов 0.

В непосредственной близости от теломерного конца гена

SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора зап-

рогаммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis

inhibitory protein -NAIP). При тяжелых клинических формах

СМА (Тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко

происходит утрата гена NAIP.

Согласно гипотезе авторов СМА возникает при гомозигот-

ном состоянии мутаций (обычно-делеций) в гене SMN, 4при этом

различ 4ия между 0форм 4ами 0СМА определяются двумя основными фак-

торами: 1. числом копий гена cBCD541 (две - в случае Типа I

и четыре (возникающих вследствие конверсии между SMN и

cBCD541) - в случае Типа III), 2. наличием или отсутствием

ген 4а 0NAIP. 4С 0реди всех обследованных СМА-больных 4не

4обнаружены 0случа 4и одновременной 0делеции обоих гомологичных

генов 4- 0SMN (tBCD541) и сBCD541 4, что 0указывает, по мнению

авторов, 4на то, 0что такая аберрация должна проявляться как

доминантная леталь еще в эмбриогенезе.

Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей

работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточне-

ния, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молеку-

лярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью прово-

дится амплификация экона 7, который отсутствует у подавляю-

щего большинства больных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) диф-

ференцируют от мутантного варианта (ген cBCD541) c помощью

SSCP анализа. При необходимости возможна косвенная диаг-

ностика - ПЦР анализ динуклеотидных (CA) повторов ДНК ло-

кусов D5S125; D5S112; D5S127; ПДРФ-анализ с фланкирующими

ДНК-зондами MU, 105-153RA; 153-6741 GT.

10.4.11 Атаксия Фридрейха.

Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1 : 22

-25 000) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующе-

еся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген

АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на

хромосомных (9q13-q21) и физических картах ДНК-маркеров. На-

иболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5

(зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и

составлены подробные физические карты области 4 0геномной ДНК

хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген

АФ. Определено положение гена ФА по отношению к другим флан-

кирующим молекулярным маркерам (Fujita etal., 1991; Wilkes

et al., 1991) 4. 0В настоящее время известно, по крайней мере,

5 таких ДНК маркеров: GS4, MCT-112, GS2 -дистальные и мик-

росателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 кб 4) 0и MLS1 (на

расстоянии 150 кб) - проксимальные. Изучены особенности ал-

лельного полиморфизма этих систем для различных популяций

Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены

гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих мик-

росателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом

неравновесии с АФ, что доказывет их весьма близкое располо-

жение на генетической карте по отношению к мутантному гену

АФ (Pianese et al., 1994).

Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами.

ПДРФ анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные

сайты, либо ПЦР анализ полиморфизма проксимальных по отноше-

нию к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1.

Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследствен-

ные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя,

главным образом, из того насколько они изучены с молекулярно

-генетических позиций, их актуальности для пренатальной ди-

агностики и в какой мере они важны для медико-генетической

службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так,

что именно такие заболевания как муковисцидоз, миодистрофия

Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурия, то 4 0есть 4 0социально наи-

более значимые, раньше других генных болезней стали предме-

том детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в

других медико-генетических центрах и научно-практических

подразделениях России (см. Баранов, 1991, 1994;

Baranov,1993; Евграфов, Макаров, 1987).

Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не

исчерпывается список тех болезней, которые являются объекта-

ми молекулярных исследований в нашей стране. Например, из

обзора выпали такие моногенные 4 0болезни как гиперхолестерине-

мия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1 антитрипсина, мито-

хондриальные болезни. 4 0Для многих из них разработаны и широко

применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ве-

дутся исследования по генотерапии. 4 0Мы не касались также ра-

бот проводимых, 4 0главным образом, 4 0в возглавляемой профессором

Е.И.Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и

посвященных молекулярному анализу мультифакториальных забо-

леваний, 4 0таких как диабет, гипертония, ишемия сердца. Ре-

зультаты этих 4 0исследований 4 0будут, по-видимому, предметом

следующих обзоров и монографий.

ГЛАВА I

СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.

Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-

тический код.

Универсальная генетическая субстанция или "энциклопедия

жизни", ДНК, содержит информацию, необходимую для синтеза

белков и нуклеиновых кислот, присутствующих во всех типах

клеток как про- так и эукариот. Дезоксирибонуклеиновые кис-

лоты (ДНК) - это нитевидные молекулы, состоящие из четырех

расположенных в варьирующем порядке нуклеотидов: пуринов -

аденина и гуанина, и пиримидинов - цитозина и тимина, соеди-

ненных в полинуклеотидную цепь с остовом из чередующихся ос-

татков сахара - дезоксирибозы, и фосфата. Последовательность

нуклеотидов ДНК или пар оснований составляет информационную

емкость молекулы, определяя порядок синтеза и аминокислотную

последовательность белков в соответствии с универсальным для

всех живых существ трехбуквенным - триплетным, генетическим

кодом (Табл.1.1). Дезоксирибонуклеиновые кислоты представля-

ют собой единственный тип молекул, способных к самовоспроиз-

водству или репликации, что и обеспечивает преемственность

генетической информации в ряду поколений. Записывается

последовательность ДНК слева направо (5' - 3') первыми заг-

лавными буквами соответствующих нуклеотидов, являющихся од-

новременно единицами измерения молекулы. Размеры ДНК могут

меняться в гигантских пределах от нескольких нуклеотидов до