века. Однако, в любом случае схемы направленной модификации
генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые
направленная сайт-специфическая модификация была выполнена
также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (см.выше)
и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделиру-
ющая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у че-
ловека (Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в
первую очередь, обусловлен существованием простых схем отбо-
ра клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном
на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован
в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.
При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсер-
цией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифи-
цируются - Рис.8.1 (см. Главу X).
В настоящее время предложено несколько вариантов для
направленного переноса неселектируемых генов за счет допол-
нительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого
маркерного гена в таком положении, при котором его экспрес-
сия происходит преимущественно при правильном встраивании
векторной последовательности в ген-мишень (рис.8.2). Так,
маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК
плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться
только находясь под контролем какого-либо другого промотора
хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна
произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.
При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет
Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к
резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомо-
логичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На
этом же принципе основано использование генетических конс-
трукций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности
в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов
среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридиза-
ции, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной пос-
ледовательности, расположенный вне направленно переносимого
участка экзогенной ДНК.
Особенно перспективным на сегоднешний день представля-
ется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Ме-
тод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция
экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где
встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.
Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными
последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК
плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный
вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции
такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбина-
ции HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при
негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в
неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противо-
герписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться ги-
белью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу
(Рис.8.3).
Отбор клеток с модифицированным геном также может про-
изводиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо
маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для
амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло-
гичен соседней с сайтом интеграции последовательности моди-
фицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируе-
мой экзогенной ДНК (Рис.8.4). Метод позволяет обнаруживать
присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди
50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в
каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При
положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и
процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать
нужные клоны.
Направленное выключение генов-мишеней может быть достиг-
нуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации
могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей,
наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена
и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и
трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет
инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего
образуется укороченный белок, незащищенный от действия кле-
точных протеаз.
Более совершенной является разработанная недавно техни-
ка двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные
по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе
ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и
прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в
нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последо-
вательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мише-
ни. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы
(Рис.8.5). После трансфекции отбираются клетки позитивные по
HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких
клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологич-
ная рекомбинация с заменой одного из экзонов на инсертиро-
ванный мини-ген HPRT. Факт такого встраивания доказывается
при помощи ПЦР. На следующем этапе инсертированный HPRT ми-
ни-ген заменяют на отсутствующий фрагмент гена-мишени, в ко-
торый предварительно вносят интересующие исследователя мута-
ции. При этом альтернативный вектор несет те же фланкирующие
ДНК-последоваельности гена-мишени, что и первый (нокаутирую-
щий) вектор. Клетки HPRT минус на этом, 2- м этапе с большой
вероятностью будут нести гомологичную рекомбинацию встроен-
ной конструкции мини-HPRT гена и альтернативного фрагмента
исходного гена. Факт такой рекомбинации контролируется с по-
мощью ПЦР. Таким образом, вместо обычного выключения функции
гена, что достигается уже на 1-м этапе, данная технология
позволяет вносить в структуру гена дикого типа различные,
заранее спланированные изменения, в том числе и специфичес-
кие мутации, аналогичные таковым при наследственных болезнях
у человека. Следовательно, данный подход позволяет проводить
более тонкое генетическое моделирование и исследовать осо-
бенности функции мутантного гена in vivo.
Для введения специфических мутаций в определенные экзо-
ны гена используют, так называемые "hit & run" векторы (Has-
ty et al., 1991). Перспективным также представляется исполь-
зование дрожжевых YAC-векторов, несущих полноразмерные
кДНК-овые последовательности гена. Так как уровень гомоло-
гичной рекомбинации у дрожжей достаточно высок, в такие
конструкции легко вводить специфические мутации и затем ис-
пользовать их для трансфекции ЭСК и получения трансгенных
животных 4.
Отбор клонов эмбриональных стволовых клеток, в которых
произошла направленная модификация гена-мишени, в значитель-
ной степени, предопределяет успех всего комплекса работ по
созданию модельной генетической линии. Однако, и дальнейшие
этапы этой программы, включающие получение химерных транс-
генных животных, идентификацию зародышевых трансмиттеров
(химер, продуцирующих трансфецированные половые клетки) и
селекцию гетерозиготных, а затем гомозиготных мутантнах осо-
бей, требуют большой квалификации, труда и времени. Осложня-
ющим обстоятельством является то, что химерные животные не-
редко имеют сниженную жизнеспособность и плодовитость. То же
может быть справедливо и в отношении гетерозиготных мутант-
ных особей. В гомозиготном состоянии инсертированные мутации
могут не только снижать жизнеспособность и плодовитость, но
и обладать летальным или полулетальным эффектом уже в прена-
тальном периоде. В таком случае линия поддерживается путем
отбора и скрещивания гетерозигот.
Несмотря на огромные методические сложности и высокую
стоимость, направленное получение моделей наследственных бо-
лезней оправдывает затраченные усилия. Мутантные животные
представляют уникальную возможность исследовать патофизиоло-
гические процессы, развивающиеся в организме вследствие на-
рушений работы определенного гена, анализировать влияние
специфических мутаций на фенотип, тестировать новые лекарс-
твенные препараты и испытывать различные терапевтические
подходы. Велика также роль генетических линий в разработке
методов генной терапии (см. Главу IX).
ГЛАВА IY.
ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК- ДИАГНОСТИКИ.
Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-
таций.
Каждый генетический локус характеризуется определенным
уровнем изменчивости, то есть присутствием различных аллелей
или вариантов последовательностей ДНК у разных индивидуумов.
Применительно к гену, аллели разделяются на две группы -
нормальные, или аллели дикого типа, при которых функция гена
не нарушена, и мутантные, приводящие к нарушению работы ге-
на. В любых популяциях и для любых генов аллели дикого типа
являются преобладающими. Под мутацией понимают все изменения
в последовательности ДНК, независимо от их локализации и
влияния на жизнеспособность особи. Таким образом, понятие
мутации является более широким по сравнению с понятием му-
тантного аллеля. Уместно, однако, заметить, что в научной
литературе сравнительно часто встречающиеся в популяциях ва-
рианты последовательностей генов, не приводящие к заметным
нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные
мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "му-
тантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.