Смекни!
smekni.com

Литература - Другое (книга по генетике) (стр. 25 из 64)

активности генов в нормальных клетках, оценку клинического

выражения различных типов нарушений гена, выявление первич-

ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку-

лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.

Естественно, что в различных тканях организма

экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.

Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо-

зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе-

чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По

весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че-

ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках

печени - основной биохимической лаборатории организма - око-

ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,

1977). Это означает, что в различных соматических клетках

эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,

1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо-

дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про-

цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях

организма происходит избирательная активация многих других

специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает

значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско-

рости их синтеза.

Контроль генной активности осуществляется за счет диф-

ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд-

рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной

трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным

результатом которой является синтез функционально активного

белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной

активности, но и полноценность всех последующих этапов,

включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность

к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и

корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре-

шающее значение для успешного анализа всего этого сложного

комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по-

иск и целенаправленное конструирование которых представляет

вполне самостоятельную научную задачу.

Наиболее доступными модельными системами для анализа

экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для кло-

нирования, генноинженерного манипулирования, направленного

введения сайт специфических мутаций, получения большого ко-

личества клонированных последовательностей ДНК, специфи-

ческих молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно

используют генетически хорошо изученные прокариотические

системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов

трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внут-

риклеточной локализации и функционирования чаще используют

культуры клеток эукариот и, в частности, специфические куль-

туры клеток человека. Особая роль в изучении начальных эта-

пов развития патологического процесса, обусловленного

присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевти-

ческих методов, включая генноинженерную коррекцию метаболи-

ческого дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это

могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полу-

ченные из специфических тканей больного человека, либо выде-

ленные из тканей линейных животных, служащих генетической

моделью наследственного заболевания.

Идентификация гомологичных генов у экспериментальных

животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряют

исследование функциональной активности нормальных и мутант-

ных генов человека. Большая роль в изучении молекулярных ме-

ханизмов развития патологических процессов in vivo принадле-

жит генетическим линиям животных. Это могут быть линии, по-

лученные в результате отбора спонтанно возникших или индуци-

рованных мутаций, а также искусственно сконструированные мо-

дели на базе трансгенных животных, в геном которых введен

чужеродный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспе-

риментальные подходы, используемые для анализа экспрессии

генов.

Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция

и исследование мРНК, искусственные

транскрипционные системы.

Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок

может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В

соответствии с этим исследования дифференциальной активности

генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы

контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех

этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и

изучение соответствующего белкового продукта, включая его

процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тка-

неспецифическое распределение .

Исследования регуляторных цис-действующих элементов ге-

нома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляю-

щие транскрипцию, являются составной частью анализа молеку-

лярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов

проводят с использованием разнообразных современных методов

молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в

5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспеци-

фическую индукцию генной активности, могут быть локализованы

путем исследования транскрипции в различных линиях клеток

при введении в них генов с искусственными делециями этих

участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регу-

ляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо

изученными неиндуцибельными клонированными генами, так назы-

ваемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в

составе векторных последовательностей вводят в культивируе-

мые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня

экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хло-

рамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естест-

венных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.

Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволя-

ет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в

клетке, но и с высокой точностью проводить количественную

оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии хи-

мерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек

африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки моди-

фицированы таким образом, что в них после трансфекции про-

исходит амплификация копий сконструированных определенным

образом эписом (внехромосомных генетических конструк-

ций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сиг-

налов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов

(трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого орга-

низма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных

манипуляций трансгенные животные могут быть также использо-

ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов

тканеспецифической активации генов in vivo.

Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для

изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных

модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95%

из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли-

руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При

этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов

среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от

0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения

индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко-

чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на

тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ

РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических

срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов

используют клонированные последовательности кДНК и синтети-

ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на

цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой

несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо-

вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли-

бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме-

тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не

только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде-

лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,

Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).

Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей

пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика-

цию среди них специфических молекул путем использования раз-

личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким

уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты

(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не

могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-

лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и

фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про-

водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью

обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-

ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон-

центрированных и фракционированных путем электрофореза моле-

кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в

агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В

этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель

находится в логарифмической зависимости от длины последова-

тельности, что позволяет точно определить размер РНК

транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде

двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-

мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы